納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)： 外泌體表征的重要技術(shù)手段

        在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，細(xì)胞間的信息傳遞與物質(zhì)交換及功能表達(dá)均依賴(lài)于一類(lèi)特殊的載體——外泌體。
        外泌體作為細(xì)胞外囊泡中重要的亞群，是直徑約 30-150 納米的膜性囊泡，其內(nèi)部攜載著蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性分子，在細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖1）。研究表明，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境等途徑支持腫瘤進(jìn)展；神經(jīng)元分泌的外泌體則參與神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控及突觸可塑性維持。這些研究的實(shí)現(xiàn)，均依賴(lài)于對(duì)外泌體物理特性（如粒徑分布、濃度水平）的精準(zhǔn)解析。
        而納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)作為解析外泌體粒徑與濃度等基本物理特性最為常用的技術(shù)手段之一，對(duì)外泌體相關(guān)的科研及醫(yī)療研究發(fā)揮著不可或缺的重要作用。

圖1  外泌體的潛在應(yīng)用

        納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）基于光散射理論與布朗運(yùn)動(dòng)分析的有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體等納米顆粒的精準(zhǔn)表征。其核心構(gòu)成及技術(shù)原理如下（圖2）：​

圖2  NTA核心結(jié)構(gòu)

        納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（NTA）通過(guò)激光散射光路系統(tǒng)，對(duì)溶液中的納米級(jí)顆粒進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。當(dāng)單束激光聚焦于樣品池時(shí)，顆粒的散射光信號(hào)被高靈敏度相機(jī)捕捉，形成實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像�；�于Stokes-Einstein方程（圖3），通過(guò)追蹤單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)軌跡并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可精確計(jì)算顆粒的流體力學(xué)直徑及濃度分布。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 10-1000 納米粒徑范圍顆粒的單顆粒分辨率檢測(cè)，尤其適用于異質(zhì)性外泌體群體的表征。

圖3  Stokes-Einstein方程

        外泌體的精準(zhǔn)表征是開(kāi)展基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提。作為納米級(jí)囊泡檢測(cè)的核心技術(shù)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）在與其他表征手段的對(duì)比中展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢(shì)。
        由于技術(shù)原理的限制，其他表征手段存在著一些缺陷：TEM技術(shù)檢測(cè)流程復(fù)雜，程耗時(shí)長(zhǎng)（ 4 小時(shí)以上），且僅能獲取局部顆粒信息，人工計(jì)數(shù)誤差率高（ 15%-20%），難以反映樣本整體分布特征；DLS技術(shù)在多分散體系檢測(cè)領(lǐng)域表現(xiàn)不佳，且易產(chǎn)生粒徑分布偏移誤差、在低豐度樣本檢測(cè)中誤差顯著增大；流式細(xì)胞術(shù)需對(duì)目標(biāo)顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，標(biāo)記過(guò)程可能改變外泌體天然屬性，且僅能提供單一熒光參數(shù)分析。
        而NTA 技術(shù)憑借其在精準(zhǔn)高效、動(dòng)態(tài)檢測(cè)、無(wú)標(biāo)記分析及可視化驗(yàn)證方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和對(duì)多分散體系檢測(cè)的優(yōu)良表現(xiàn)，顯著彌補(bǔ)了傳統(tǒng)外泌體表征技術(shù)的局限性。并且，由于NTA對(duì)外泌體檢測(cè)沒(méi)有任何預(yù)處理要求，即直接對(duì)提取的原生態(tài)外泌體樣本（最接近生理?xiàng)l件）進(jìn)行檢測(cè)，使得NTA能夠精準(zhǔn)刻畫(huà)外泌體的物理化學(xué)特性，為深入探索外泌體功能機(jī)制提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。其在不同應(yīng)用場(chǎng)景下展現(xiàn)出的精準(zhǔn)性與高效性，為后續(xù)在外泌體研究各領(lǐng)域的深入應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
        基于此，NTA技術(shù)已經(jīng)是外泌體研究不可或缺的一種重要分析手段，以下將通過(guò)具體應(yīng)用案例，進(jìn)一步展現(xiàn)其在實(shí)際研究與臨床實(shí)踐中的重要價(jià)值。

圖4  案例文獻(xiàn)1

        《Nanoparticle tracking analysis monitors microvesicle and exosome secretion from immune cells》研究中（圖4），NTA 被用于監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞（如 Jurkat T 細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞）在刺激（離子載體、LPS）或抑制（基因敲低、分泌抑制劑）條件下的 EVs 分泌動(dòng)態(tài)。NTA 可動(dòng)態(tài)追蹤 EVs 濃度變化，如離子載體刺激使 Jurkat T 細(xì)胞 EVs 濃度增加 43%-126%，LPS 激活樹(shù)突狀細(xì)胞后 EVs 分泌 48 小時(shí)達(dá)峰值；通過(guò)粒徑分布區(qū)分微囊泡（100-1000 nm）與外泌體（30-150 nm），發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞分泌的 EVs 以 70-90 nm 為主（圖5）；結(jié)合抗 CD45 免疫磁珠去除 T 細(xì)胞來(lái)源 EVs，NTA 信號(hào)減少 60%，驗(yàn)證檢測(cè)特異性。該技術(shù)為免疫細(xì)胞 EVs 分泌與激活狀態(tài)的關(guān)聯(lián)研究提供了精準(zhǔn)的定量工具。

圖5  該案例研究中，NTA測(cè)得的外泌體粒徑與濃度

        該研究證明，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)通過(guò)單顆粒實(shí)時(shí)追蹤，能對(duì)細(xì)胞 EVs實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的粒徑與濃度表征， 為EVs相關(guān)的各學(xué)科科研工作、及EVs檢測(cè)作為技術(shù)手段的臨床醫(yī)療研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

圖6  案例文獻(xiàn)2

        在比較 FBS 與 HPL 培養(yǎng)的 MSC-EVs 研究中（圖6），NTA 作為核心表征工具：測(cè)定 F-EVs 與 H-EVs 粒徑均約 150 nm，量化 H-EVs 顆粒濃度較 F-EVs 高 1.5 倍，證實(shí) HPL 促進(jìn) EVs 分泌；通過(guò)顆粒數(shù) / 蛋白質(zhì)量比驗(yàn)證兩者純度均超 1×10⁸ particles/μg，符合臨床級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（圖7）；在體外血管生成和體內(nèi)腎損傷模型中，基于 NTA 濃度數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn) EVs 給藥劑量的標(biāo)準(zhǔn)化控制。NTA 通過(guò)精準(zhǔn)量化 EVs 物理特性，為無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基篩選、EVs 產(chǎn)量評(píng)估及功能實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化提供數(shù)據(jù)支撐，推動(dòng) MSC-EVs 在再生醫(yī)學(xué)中的機(jī)制研究與轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

圖7  不同通路的充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）及其來(lái)源細(xì)胞外囊泡（MSC-EVs）的特性分析

        該研究證實(shí)，NTA技術(shù)通過(guò)精準(zhǔn)量化外泌體的物理特性，為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體的研究提供了核心數(shù)據(jù)支撐，其單顆粒追蹤特性為解析 EVs 分泌動(dòng)力學(xué)（如缺氧或藥物刺激下的釋放規(guī)律）提供了量化依據(jù)，推動(dòng) EVs 在再生醫(yī)學(xué)中的機(jī)制研究與標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化，成為連接基礎(chǔ)科研與臨床應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)橋梁。

圖8  案例文獻(xiàn)3

        《Enhancing immunogenicity and release of in situ-generated tumor vesicles for autologous vaccines》研究中（圖8），NTA 用于評(píng)估 Combo-NPs@shGNE 納米顆粒原位疫苗策略：檢測(cè)到該策略使 TEV 釋放率提升至 56.44%（較空白組高 9.57 倍），TEV 濃度達(dá) 1.2×10⁸ particles/10⁶ cells，粒徑分布更集中；體內(nèi)腫瘤組織中，NTA 顯示治療組 TEV 顆粒數(shù)較空白組提升 1.32 倍，且與 HSP70 等免疫刺激分子含量正相關(guān)；TEV 濃度數(shù)據(jù)直接關(guān)聯(lián)腫瘤生長(zhǎng)抑制率，成為評(píng)估疫苗效果的關(guān)鍵參數(shù)（圖9）。NTA 通過(guò)量化 TEV 粒徑、濃度及釋放效率，為原位疫苗的機(jī)制驗(yàn)證與療效評(píng)估提供了核心技術(shù)支撐。

圖9  NTA測(cè)定 TEV 的粒徑分布和粒子數(shù)

        在該研究證明，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)完全能夠作為驗(yàn)證研究假設(shè)和評(píng)估治療效果的核心工具，用于細(xì)胞外囊泡（包括外泌體）的粒徑分布、顆粒濃度及釋放效率的定量表征，發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

        納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)憑借其高分辨率、快速檢測(cè)和可視化驗(yàn)證等優(yōu)勢(shì)和對(duì)多分散體系檢測(cè)的優(yōu)良表現(xiàn)，在外泌體相關(guān)各領(lǐng)域研究中發(fā)揮著不可或缺的重要作用：在基礎(chǔ)研究中，其通過(guò)解析外泌體的粒徑分布與濃度特征，助力揭示外泌體在細(xì)胞間通訊中的作用機(jī)制，如腫瘤細(xì)胞外泌體促血管生成、神經(jīng)元外泌體調(diào)控神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程；在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，NTA 為間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體（MSC-EVs）的培養(yǎng)基篩選、產(chǎn)量評(píng)估及質(zhì)量控制提供核心支撐，推動(dòng)無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基的臨床轉(zhuǎn)化；在臨床治療策略開(kāi)發(fā)中，可用于監(jiān)測(cè)腫瘤原位疫苗誘導(dǎo)的囊泡釋放效率、評(píng)估免疫原性囊泡的粒徑均一性，為個(gè)性化疫苗優(yōu)化提供量化依據(jù)；在疾病診斷與療效監(jiān)測(cè)方面，NTA 通過(guò)動(dòng)態(tài)追蹤血液、尿液等樣本中外泌體的物理特性變化，為腫瘤早期篩查、病程進(jìn)展判斷及治療響應(yīng)評(píng)估提供技術(shù)支持；此外，在藥物遞送系統(tǒng)研究中，NTA 可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外泌體載藥前后的粒徑變化與濃度波動(dòng)，輔助優(yōu)化載藥工藝并確保給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)化，全面推動(dòng)外泌體在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
        NTA已成為外泌體研究的不可替代的工具。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新，NTA 必將進(jìn)一步推動(dòng)外泌體的基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化，在相關(guān)的生物生命科學(xué)研究、各類(lèi)疾病診斷和治療中發(fā)揮更大作用。