成骨細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激或自噬減少不足以模擬衰老對(duì)骨機(jī)械反應(yīng)性損害

Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness

Keywords: Atg7; Osx1-Cre; Sod2; osteocytes; tibia compressive loading.

運(yùn)動(dòng)引起的機(jī)械負(fù)荷，特別是負(fù)重沖擊，通過(guò)刺激成骨細(xì)胞（分泌骨基質(zhì)的細(xì)胞）促進(jìn)骨形成來(lái)增加骨量。成骨細(xì)胞數(shù)量和骨形成的減少是人類和小鼠隨著年齡增長(zhǎng)而骨量流失的主要因素。衰老機(jī)制，如活性氧（ROS）過(guò)量或自噬減少，與老化骨骼中骨形成減少有關(guān)。骨骼中線粒體（mt）ROS 隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，它們?cè)陂g充質(zhì)譜系細(xì)胞（包括成骨細(xì)胞前體、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞）中的衰減抵消了老齡小鼠骨量的損失。線粒體呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的線粒體 ROS 受到涉及超氧化物歧化酶2（Sod2）的抗氧化防御機(jī)制的對(duì)抗。與 mtROS 對(duì)骨骼衰老影響的貢獻(xiàn)一致，成骨細(xì)胞系細(xì)胞中 Sod2 的缺失會(huì)降低骨形成和骨量。

自噬，通過(guò)回收細(xì)胞內(nèi)成分（如錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)或受損的細(xì)胞器）來(lái)維持細(xì)胞功能和體內(nèi)平衡。在使用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（Dmp1）-、Osterix 1（Osx1）- 和 I 型膠原α 1（Col1a1）-Cre 靶向細(xì)胞的成骨細(xì)胞譜系中，缺失必要的自噬相關(guān)基因，如Atg7、Atg5 和 RB1CC1，證明了自噬對(duì)骨形成的作用。自噬隨著年齡的增長(zhǎng)而變得不那么有效，并可能導(dǎo)致老齡小鼠的骨形成減少。機(jī)械力，如壓縮應(yīng)力和流體剪切應(yīng)力，已被證明可以增強(qiáng)骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中的自噬通量。

盡管有證據(jù)支持過(guò)量的 mtROS 或自噬的降低導(dǎo)致衰老過(guò)程中成骨細(xì)胞生成和骨量減少，但這些機(jī)制是否會(huì)特異性影響骨機(jī)械反應(yīng)性仍是未知數(shù)。最近，美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌和代謝學(xué)系、生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系及肌肉骨骼疾病研究中心的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢查了成骨細(xì)胞系細(xì)胞中自噬減少或 mtROS 增加是否會(huì)損害機(jī)械刺激下的成骨反應(yīng)。研究成果發(fā)表于 Aging 期刊題為“Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness”。



首先，比較了幼齡（6 個(gè)月）和老齡（21 個(gè)月）雌性 C57BL/6J 小鼠對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)，對(duì)小鼠左脛骨施加軸向壓縮負(fù)荷（4 Hz，-7.8 N / -6.6 N），右脛骨用作對(duì)照。Micro-CT分析顯示，在中軸或距脛腓遠(yuǎn)端連接處近5毫米處，負(fù)荷對(duì)幼齡和老齡小鼠的皮質(zhì)厚度沒(méi)有顯著影響。由于礦化表面和礦物質(zhì)附著率的增加，通過(guò)鈣黃綠素-茜素雙重標(biāo)記測(cè)量的骨形成率在 6 個(gè)月大的小鼠外（骨膜）負(fù)荷的脛骨表面增加。在 21 個(gè)月大小鼠的負(fù)荷脛骨中也檢測(cè)到這些成骨作用，然而，老齡小鼠負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成率的幅度顯著降低。

此外，還研究了超過(guò)骨骼在正常日常活動(dòng)中經(jīng)歷的更高程度的壓力如何影響老齡小鼠的機(jī)械反應(yīng)性，即對(duì)6 月齡和 21 月齡雌性 C57BL/6J 小鼠的左脛骨分別加載 -10N 和 -8.5N 的壓縮負(fù)荷。由于骨膜周長(zhǎng)增加，兩周的負(fù)荷增加了幼齡小鼠負(fù)荷脛骨中軸和近端部位的皮質(zhì)厚度，而在骨內(nèi)膜表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)影響（圖1 A、B）。老齡老鼠的負(fù)荷也引起了類似的效果，然而，顯微 CT 觀察到老齡小鼠在其負(fù)荷的脛骨中形成了編織骨。這種現(xiàn)象通常發(fā)生在骨骼損傷的反應(yīng)，例如微骨折。組織形態(tài)學(xué)分析證實(shí)了不規(guī)則編織骨的形成，尤其是在骨膜表面（圖1 C）。這些結(jié)果表明，衰老會(huì)降低骨膜對(duì)機(jī)械刺激的成骨反應(yīng)，與年輕骨骼相比，衰老骨骼響應(yīng)增加的機(jī)械需求而形成新骨骼的能力大大減弱。
 

圖1 較高的機(jī)械應(yīng)變導(dǎo)致老齡小鼠骨膜編織骨形成。

接下來(lái)，研究了 Sod2 缺失引起的過(guò)量 mtROS 是否會(huì)損害響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的成骨反應(yīng)，在成骨細(xì)胞系細(xì)胞中生成 Sod2 缺失小鼠（Sod2^ΔOsx1）。定量 RT-PCR 分析證實(shí)，Sod2^ΔOsx1 小鼠骨髓來(lái)源的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中 Sod2 mRNA 表達(dá)水平降低，且Sod2 的減少增加了 mtROS 水平。

然后，將 12 月齡的雌性 Sod2^ΔOsx1 小鼠及其 Osx1-Cre 對(duì)照小鼠的左脛骨以 -8.5N 加載兩周，發(fā)現(xiàn)負(fù)荷增加脛骨近端和中軸的皮質(zhì)厚度。一致地，在骨髓面積、總面積、皮質(zhì)面積、極性慣性矩或脛骨中軸的物質(zhì)密度方面，沒(méi)有觀察到基因型相關(guān)的差異。Sod2^ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠在負(fù)荷的脛骨骨膜和骨內(nèi)膜表面增加的骨形成率、礦化表面和礦物質(zhì)附著率沒(méi)有區(qū)別（圖2 A-C）。這些結(jié)果表明，成骨細(xì)胞系細(xì)胞中 mtROS 的增加不足以影響骨合成代謝對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)。
 

圖2 成骨細(xì)胞譜系中過(guò)量的線粒體 ROS 不會(huì)影響負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成。

最后，為了驗(yàn)證成骨細(xì)胞中的自噬減少是否可能解釋衰老過(guò)程中負(fù)荷誘導(dǎo)的骨形成降低，構(gòu)建 Atg7^ΔOsx1 小鼠。為了確認(rèn)自噬的抑制，使用免疫印跡分析測(cè)量了成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中 LC3 和 p62 的水平（圖3 A）。LC3-I 到 LC3-II 的轉(zhuǎn)化通常用作自噬水平的指標(biāo)。p62 是一種經(jīng)典的自噬底物，將細(xì)胞內(nèi)自噬物質(zhì)運(yùn)輸?shù)阶允审w進(jìn)行降解，p62水平升高通常被認(rèn)為是自噬活性受到抑制的標(biāo)志。結(jié)果表明，表達(dá)Osx1-Cre的細(xì)胞中Atg7的缺失抑制了自噬體的形成，從而抑制了自噬，如LC3轉(zhuǎn)化和p62積累減少所示（圖3 A）。

之前已經(jīng)表明，Atg7 的缺失會(huì)大大降低皮質(zhì)骨中的樹(shù)突連接。據(jù)推測(cè)，骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的退化會(huì)損害骨合成代謝對(duì)負(fù)荷的反應(yīng)。因此，評(píng)估了骨細(xì)胞突起的密度，這是骨細(xì)胞嵌入骨基質(zhì)時(shí)形成的（圖3 B）。與 Osx1-Cre 對(duì)照相比，Atg7^ΔOsx1 小鼠的平均熒光強(qiáng)度歸一化到骨區(qū)域，指示骨細(xì)胞突起的數(shù)量和大小顯著降低（圖3 C）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，成骨細(xì)胞譜系中 Atg7 的缺失會(huì)破壞骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的形成或維持。此外，Atg7^ΔOsx1 小鼠的骨細(xì)胞體比對(duì)照組大（圖3 C），這可能是由于細(xì)胞質(zhì)成分的積累，這些成分通常在從成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞的過(guò)程中被降解。

進(jìn)一步地，分別用 -7.3 N 和 -7.6N 加載 10 月齡的雌性 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 對(duì)照小鼠的左脛骨。兩周的負(fù)荷增加了 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 小鼠脛骨中軸和近端的皮質(zhì)厚度。在髓質(zhì)面積、總面積、極慣性矩或負(fù)荷脛骨中軸的物質(zhì)密度方面，沒(méi)有觀察到基因型相關(guān)的差異。此外，在 Atg7ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠中，負(fù)荷增加了骨膜和骨內(nèi)膜表面的骨形成率、礦化表面和礦物質(zhì)附著率，其程度相似。這些結(jié)果表明，成骨細(xì)胞系細(xì)胞中自噬的減少不足以改變機(jī)械刺激下的成骨反應(yīng)。
 

圖3 成骨細(xì)胞系細(xì)胞中的 Atg7 缺失會(huì)破壞骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

總之，該研究表明，成骨細(xì)胞中 mtROS 的增加或 Atg7-依賴性自噬的減少，以及骨細(xì)胞樹(shù)突數(shù)量減少——骨骼老化的常見(jiàn)特征——不會(huì)導(dǎo)致衰老過(guò)程中的機(jī)械反應(yīng)性降低。在肌肉中，與低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平相關(guān)的線粒體代謝改變與老年人身體活動(dòng)的反應(yīng)降低有關(guān)。對(duì)老齡小鼠施用 NAD + 前體可減輕骨量的損失。刺激 NAD+ 是否也能促進(jìn)骨骼機(jī)械反應(yīng)性需要未來(lái)進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：Resende-Coelho A, Ali MM, James A, Warren A, Gatrell L, Kadhim I, Fu Q, Xiong J, Onal M, Almeida M. Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness. Aging (Albany NY). 2025 Mar 18;17(3):610-629. doi: 10.18632/aging.206213. Epub 2025 Mar 18. PMID: 40105873; PMCID: PMC11984430.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40105873/

Online ISSN: 1945-4589

IF：5.9

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