智能定點整合技術(shù)助力細胞株精準高效開發(fā)
前些年，細胞株開發(fā)領(lǐng)域?qū)晒饧毎Y選技術(shù)持謹慎態(tài)度，主要體現(xiàn)在外源DNA/蛋白引入，用于生產(chǎn)治療性蛋白（如抗體）的細胞株開發(fā)中，監(jiān)管機構(gòu)（如FDA、EMA）要求最終的生產(chǎn)細胞株盡可能“干凈”，引入熒光蛋白基因及其伴隨的選擇標記基因（如抗生素抗性基因）被視為不必要的外源遺傳物質(zhì)，增加了產(chǎn)品的復雜性和潛在安全風險（如免疫原性）。這些外源基因必須在最終的生產(chǎn)主細胞庫和工作細胞庫中被移除或證明不存在，這增加了額外的驗證成本、負擔和風險。
近兩年熒光標記技術(shù)興起的轉(zhuǎn)機來自于一項融合人工智能與基因編輯的可將生物藥開發(fā)時間從6個月縮短至1.5個月的創(chuàng)新技術(shù)-智能定點整合。在2024年BPI US West會議上，Pfizer、Genentech、Takeda等巨頭紛紛展示了各自的定點整合平臺：Pfizer采用雙質(zhì)粒雙位點策略，通過BxB1整合酶將兩個不同載體分別整合到兩個獨立位點，用紅綠熒光標記篩選無熒光轉(zhuǎn)化子。
Pfizer演講現(xiàn)場（BPI US West展會）[1]
Genentech則開發(fā)了單一位點多質(zhì)粒順序整合技術(shù)，成功實現(xiàn)了一個knob-into-hole雙抗的11g/L高表達；AbbVie和MSD的聯(lián)合分析顯示，傳統(tǒng)細胞株開發(fā)平均耗時24-28周，而定點整合技術(shù)可縮短70%以上時間。
Genentech演講現(xiàn)場（BPI US West展會）[1]
國內(nèi)也有一些定點整合平臺，如大灣生物AlfaCell平臺已與鼎康生物CDMO平臺深度整合，為全球客戶提供全流程加速服務；博安生物則在2024年10月推出了BA-Fastcell®平臺[2]。
技術(shù)革新：智能定點整合的本質(zhì)突破
智能定點整合技術(shù)（Intelligent Site-Specific Integration，SSI）是基因編輯技術(shù)、人工智能算法與自動化設(shè)備的完美融合。與傳統(tǒng)隨機整合（RTI）相比，它實現(xiàn)了從“盲目撒網(wǎng)”到“精準投放”的根本轉(zhuǎn)變。
SSI帶來的變革是全方位的，主要體現(xiàn)在四個關(guān)鍵維度：
開發(fā)速度飛躍
將傳統(tǒng)24-28周的周期壓縮至6周。大灣生物展示的數(shù)據(jù)顯示，從DNA轉(zhuǎn)染到獲得研究細胞庫（RCB）僅需1.5個月。深圳太力生物的服務明確承諾1.5個月內(nèi)交付穩(wěn)定高產(chǎn)單克隆。
產(chǎn)量質(zhì)量雙升
表達量普遍達5g/L以上，是傳統(tǒng)方法的1.5-2倍。更值得關(guān)注的是，雙抗正確配對率突破80%，產(chǎn)品純度可達98.8%。穩(wěn)定性也顯著提升，達到100%穩(wěn)定性傳遞。
成本大幅降低
僅用“1塊96孔板”即可完成單克隆篩選，避免大量重復工作。Pfizer等企業(yè)的實踐表明，定點整合技術(shù)可減少30%以上的開發(fā)成本。
監(jiān)管路徑優(yōu)化
均一性極高的細胞池獲得監(jiān)管機構(gòu)認可，成為IND時間線突破的新窗口。在BPI Asia 2024會議上，專家指出定點整合細胞株的數(shù)據(jù)一致性顯著簡化了審批流程。
SSI核心技術(shù)采用兩步走策略：
第一步：熒光宿主細胞構(gòu)建與篩選
利用CRISPR-Cas9等基因編輯工具，在CHO細胞基因組中篩選高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，插入包含熒光蛋白（如GFP）及重組酶識別位點（如BxB1 attP位點）作為“著陸墊”（landing pad）。此階段需篩選獲得熒光均一、生長穩(wěn)健的單克隆宿主細胞。
第二步：目的基因精準整合與篩選
將包含目標基因（如抗體序列）和同源重組臂的表達載體導入宿主細胞，利用重組酶介導的位點特異性重組，將目標基因精準置換熒光標記。成功整合的細胞會失去熒光信號，成為“無熒光轉(zhuǎn)化子”。此階段需篩選出成功整合的無熒光的陽性克隆。
Cytena單細胞打印機在智能定點整合技術(shù)中的應用
宿主細胞篩選階段
基于熒光強度高效分選陽性宿主細胞，溫和的噴墨技術(shù)確保細胞活力。
目的基因整合后細胞篩選階段
目的基因整合后細胞篩選階段：在一群熒光細胞中反向精準分選無熒光細胞（即成功整合的細胞），其噴嘴圖像可提供單細胞來源的證據(jù)，單細胞率>95%。
Cytena設(shè)備的獨特優(yōu)勢在于：分選溫和、快速、單細胞率高，熒光和非熒光細胞都能高效分選、使用無菌一次性墨盒杜絕交叉污染、結(jié)合成像設(shè)備可提供完整的克隆生長追蹤報告，完全滿足FDA單克隆源性要求。
智能定點整合單克隆篩選流程圖
站在生物制藥工業(yè)化的轉(zhuǎn)折點上，智能定點整合技術(shù)代表的不僅是效率提升，更是一種研發(fā)范式的根本轉(zhuǎn)變——從隨機試錯走向理性設(shè)計，從人工操作邁向智能自動化。
然而，一個不可忽視的現(xiàn)實是：市場上定制一個采用智能定點整合技術(shù)開發(fā)的優(yōu)質(zhì)細胞株，價格往往高達上千萬人民幣。這對于許多研發(fā)管線豐富、項目迭代快的生物技術(shù)公司，尤其是處于發(fā)展關(guān)鍵期的Biotech而言，無疑是一筆沉重的負擔，讓不少企業(yè)望而卻步。這高昂的“入場券”，反而點燃了另一股燎原之火——越來越多的企業(yè)不再滿足于“購買服務”，而是開始戰(zhàn)略性“投資未來”，著手自主組建智能定點整合技術(shù)平臺！
自主平臺的構(gòu)建離不開關(guān)鍵設(shè)備的投入，Cytena單細胞打印機是平臺的核心硬件，貫穿宿主細胞篩選和目的基因整合細胞篩選兩大關(guān)鍵步驟，確保高效率、高活力、合規(guī)的單克隆分離。
參考資料：
【1】筆者親歷丨定點整合殺瘋了的BPI US West現(xiàn)場
【2】博安生物定點整合細胞株開發(fā)平臺BA-Fastcell®亮相BPI Asia 2024
