豬瘟E2病毒單克隆抗體的制備流程及關(guān)鍵參數(shù)

一、抗體結(jié)構(gòu)參數(shù)
豬瘟 E2 單克隆抗體（mAb）為典型的鼠源 IgG 類抗體（多數(shù)為 IgG1 或 IgG2a 亞型），基本結(jié)構(gòu)如下：
整體結(jié)構(gòu)：由 2 條重鏈（H 鏈）和 2 條輕鏈（L 鏈）通過(guò)二硫鍵連接形成 “Y” 型結(jié)構(gòu)，分子量約 150 kDa。
功能區(qū)域：
可變區(qū)（V 區(qū)）：重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成抗原結(jié)合位點(diǎn)（CDR，互補(bǔ)決定區(qū)），負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 E2 蛋白的表位（線性或構(gòu)象表位）。
恒定區(qū)（C 區(qū)）：重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）決定抗體亞型（如 IgG1 的 Fc 段可與補(bǔ)體或細(xì)胞表面 Fc 受體結(jié)合），輕鏈恒定區(qū)（CL）輔助維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
糖基化修飾：部分單抗的 Fc 段存在 N - 糖基化位點(diǎn)，影響抗體的半衰期和效應(yīng)功能（如補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性，CDC）。

二、靶向的 E2 蛋白毒株
E2 蛋白是 CSFV 的主要抗原，不同毒株的 E2 序列存在一定變異，但核心表位（尤其是中和表位）相對(duì)保守。單抗靶向的常見(jiàn)毒株包括：
經(jīng)典毒株：如 C 株（兔化弱毒疫苗株，E2 基因高度保守）、Alfort 株、Brescia 株。
流行野毒株：如國(guó)內(nèi)分離的 Shimen 株、GXWZ02 株，歐洲的 Paderborn 株等。
重組毒株：通過(guò)原核（如大腸桿菌）或真核系統(tǒng)（如桿狀病毒、CHO 細(xì)胞）表達(dá)的重組 E2 蛋白（保留天然構(gòu)象表位），是單抗制備的主要免疫原來(lái)源。
注：優(yōu)質(zhì)單抗通常能識(shí)別多個(gè)流行毒株的 E2 蛋白（因保守表位交叉識(shí)別），但對(duì)基因高度變異的毒株可能存在識(shí)別效率差異。

三、制備流程及關(guān)鍵參數(shù)
1. 制備步驟
免疫原：重組 E2 蛋白（純度≥90%，濃度 50-100μg / 劑）或滅活 CSFV（滴度≥10⁶ TCID₅₀/mL）。
免疫方案：BALB/c 小鼠腹腔或皮下免疫，基礎(chǔ)免疫 3 次（間隔 2 周），加強(qiáng)免疫 1 次（融合前 3 天），血清效價(jià)需≥1:10⁴（ELISA 檢測(cè)）。
細(xì)胞融合：脾臟 B 細(xì)胞與 SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞融合，融合率≥30%，雜交瘤克隆形成率≥50%。
篩選方法：
初篩：間接 ELISA（包被重組 E2 蛋白，OD450 值≥0.8 且陰性對(duì)照 < 0.2 為陽(yáng)性）。
復(fù)篩：免疫熒光（IFA，感染 CSFV 的 PK-15 細(xì)胞中出現(xiàn)特異性熒光）、中和試驗(yàn)（檢測(cè)病毒中和活性）。
克隆純化：有限稀釋法克隆 3 次以上，確保雜交瘤細(xì)胞株單克隆性（染色體數(shù)目穩(wěn)定，約 90-100 條）。
抗體生產(chǎn)：腹水誘生（效價(jià) 1:10⁵-10⁷）或無(wú)血清培養(yǎng)（濃度 50-200μg/mL），Protein G 親和純化后純度≥95%。
2. 制備關(guān)鍵參數(shù)
雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性：連續(xù)傳代 30 次以上仍能穩(wěn)定分泌抗體（效價(jià)波動(dòng)≤2 倍）。
抗體效價(jià)：ELISA 效價(jià)≥1:10⁶（腹水）或 1:10⁵（細(xì)胞上清）；中和效價(jià)（NT₅₀）≥1:128（針對(duì)強(qiáng)毒株）。

四、特異性與交叉反應(yīng)率
1. 特異性
抗原特異性：僅與 CSFV E2 蛋白結(jié)合，不識(shí)別 CSFV 的其他結(jié)構(gòu)蛋白（如 E0、E1）或非結(jié)構(gòu)蛋白（如 NS3）。
病毒特異性：通過(guò) IFA 或中和試驗(yàn)驗(yàn)證，僅與 CSFV 反應(yīng)，不與其他豬源病毒（如豬圓環(huán)病毒 PCV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV）交叉反應(yīng)。
2. 交叉反應(yīng)率
與瘟病毒屬其他病毒：因 CSFV 與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）同屬瘟病毒屬，部分單抗可能存在交叉（交叉率≤5% 為優(yōu)質(zhì)單抗），需通過(guò) ELISA 或中和試驗(yàn)排除（如對(duì) BVDV 的 OD450 值 / CSFV OD450 值 < 0.1）。
與不同 CSFV 毒株：對(duì)主流流行株（如 2.1 亞型、2.2 亞型）的識(shí)別率≥95%，對(duì)基因變異株（如部分 3.4 亞型）的交叉率可能降至 80%-90%（需通過(guò)序列比對(duì)確認(rèn)表位保守性）。

五、其他關(guān)鍵參數(shù)
親和力：通過(guò)表面等離子體共振（SPR）測(cè)定，解離常數(shù)（KD）通常為 10⁻⁸-10⁻¹⁰ M（KD 值越小，親和力越高）。
熱穩(wěn)定性：37℃放置 7 天，效價(jià)保留率≥80%；-20℃凍存 1 年，效價(jià)無(wú)顯著下降。
應(yīng)用適應(yīng)性：適合 ELISA、IFA、Western blot、中和試驗(yàn)等方法，稀釋倍數(shù)范圍寬（如 ELISA 工作濃度 1:5000-1:20000）。