非洲豬瘟病毒P72蛋白抗體（單克隆抗體）在 ASF 防控中的應(yīng)用
非洲豬瘟病毒（ASFV）的 P72 蛋白（由 B646L 基因編碼）是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒粒子的衣殼，具有極高的保守性和免疫原性，是非洲豬瘟（ASF）診斷、病毒檢測(cè)及基礎(chǔ)研究的核心靶標(biāo)之一。針對(duì) P72 蛋白的抗體（尤其是單克隆抗體）在 ASF 防控中應(yīng)用廣泛，以下從多維度詳細(xì)解析：
一、P72 蛋白的核心特征
- 維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；
- 參與病毒對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別與吸附；
- 作為病毒最保守的蛋白之一，在不同基因型 ASFV 中氨基酸序列同源性高達(dá) 90% 以上，是跨毒株檢測(cè)的理想靶標(biāo)。
- 由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過(guò)二硫鍵連接，形成典型的 “Y” 型結(jié)構(gòu)。
- 分子量約 150 kDa（IgG 型），其中重鏈約 50 kDa，輕鏈約 25 kDa。
- 可變區(qū)（V 區(qū)）：位于 “Y” 型頂端，由重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成，負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 P72 蛋白的抗原表位（線(xiàn)性表位或構(gòu)象表位），是抗體靶向結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
- 恒定區(qū)（C 區(qū)）：包括重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）和輕鏈恒定區(qū)（CL），決定抗體的類(lèi)型（如 IgG1、IgG2a 等亞型）及效應(yīng)功能（如結(jié)合 Fc 受體、激活補(bǔ)體等）。
- 單克隆抗體以 IgG 型為主（如小鼠 IgG1、IgG2b），因其穩(wěn)定性強(qiáng)、親和力高，適合用于診斷試劑；
- 多克隆抗體多為兔源或羊源 IgG，可識(shí)別 P72 的多個(gè)表位，靈敏度更高。
- 基因 Ⅱ 型：全球主流流行株（如 Georgia 2007 株、我國(guó)流行的變異株）；
- 基因 Ⅰ 型：西非、歐洲經(jīng)典株（如 L60 株、BA71V 株）；
- 其他基因型：基因 Ⅲ-ⅩⅧ 型（非洲地方性流行株）。
其跨毒株識(shí)別能力源于 P72 蛋白的高度保守性（不同基因型間氨基酸序列同源性 > 90%），是 ASF 通用診斷的核心依據(jù)。
1. 單克隆抗體制備
- 免疫原：通過(guò)原核表達(dá)（大腸桿菌）或真核表達(dá)（昆蟲(chóng)細(xì)胞、HEK293）系統(tǒng)重組表達(dá) P72 全長(zhǎng)蛋白或優(yōu)勢(shì)抗原片段（如第 1-300 位氨基酸），純化后作為免疫原。
- 雜交瘤構(gòu)建：
- 用重組 P72 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾臟淋巴細(xì)胞；
- 與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）融合，通過(guò) HAT 選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞；
- 采用 ELISA、Western blot 等方法篩選能特異性結(jié)合 P72 蛋白的陽(yáng)性克隆，經(jīng)有限稀釋法克隆化，獲得穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株。
- 抗體純化：從雜交瘤細(xì)胞上清或小鼠腹水（腹腔接種雜交瘤細(xì)胞）中，通過(guò)蛋白 A/G 親和層析純化，純度可達(dá) 95% 以上。
- 以重組 P72 蛋白免疫兔、羊等動(dòng)物，定期采血收集抗血清；
- 用 P72 蛋白偶聯(lián)的親和層析柱純化血清，去除非特異性抗體，獲得多克隆抗體。其優(yōu)勢(shì)是可識(shí)別多個(gè)表位，靈敏度高，但批次差異較大。
- 與 ASFV 的特異性結(jié)合：僅識(shí)別 ASFV 感染細(xì)胞或病毒粒子中的 P72 蛋白，不與其他豬源病毒（如豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、偽狂犬病病毒等）發(fā)生交叉反應(yīng)，確保診斷的專(zhuān)一性。
- 表位特異性：?jiǎn)慰寺】贵w通常針對(duì) P72 蛋白的單一表位（如線(xiàn)性表位 “Gly120-Ser135” 或構(gòu)象表位），多克隆抗體則覆蓋多個(gè)表位，可根據(jù)需求組合使用（如雙抗體夾心法中，捕獲抗體和檢測(cè)抗體針對(duì)不同表位，提高檢測(cè)特異性）。
- 與其他病毒的交叉率：極低（通常 < 0.1%），因 P72 蛋白是 ASFV 特有，與其他病毒無(wú)同源序列，故無(wú)交叉反應(yīng)。
- 與不同 ASFV 毒株的交叉率：極高（通常 > 95%），由于 P72 蛋白高度保守，優(yōu)質(zhì)抗體可識(shí)別所有已知基因型毒株。僅當(dāng)個(gè)別毒株的 P72 抗原表位發(fā)生罕見(jiàn)突變（如氨基酸替換）時(shí)，可能導(dǎo)致交叉率下降（但此類(lèi)情況極少）。
- 親和力：?jiǎn)慰寺】贵w的親和力常數(shù)（Ka）通常為 10⁸-10¹⁰ L/mol，確保與 P72 蛋白的高效結(jié)合；
- 效價(jià)：ELISA 效價(jià)（終點(diǎn)稀釋倍數(shù)）可達(dá) 1:10⁶以上（單克隆抗體上清）或 1:10⁷以上（多克隆抗血清）；
- 穩(wěn)定性：在 - 20℃可保存 2 年以上，4℃可穩(wěn)定 6 個(gè)月，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
- 診斷試劑：是 ASF 抗原檢測(cè)（如 ELISA、膠體金試紙條、熒光定量 PCR 配套抗體）和抗體檢測(cè)的核心試劑，可用于豬群篩查、病毒溯源；
- 基礎(chǔ)研究：通過(guò)免疫熒光、免疫電鏡定位 P72 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，研究其在病毒組裝、入侵中的功能；
- 疫苗研發(fā)：作為評(píng)價(jià)候選疫苗免疫效果的指標(biāo)（如檢測(cè)免疫豬群的抗 P72 抗體水平）。
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