Elisa實(shí)驗(yàn)—ELISA板包被原理、操作步驟及常見(jiàn)問(wèn)題解答

　　Elisa實(shí)驗(yàn)：ELISA板包被原理

　　ELISA板包被原理

　　在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))實(shí)驗(yàn)中，包被(Coating) 是最關(guān)鍵的第一步，目的是將目標(biāo)分子(抗原或抗體)固定在微孔板表面，以便后續(xù)與檢測(cè)物(抗體或抗原)結(jié)合。以下是·本生小編對(duì)ELISA板包被的詳細(xì)原理和步驟的總結(jié)：

　　1. 包被的基本原理

　　包被的本質(zhì)是通過(guò)物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)的方式，將蛋白質(zhì)(抗原/抗體)固定在微孔板(通常是聚苯材質(zhì))的孔壁上。

　　(1) 物理吸附(被動(dòng)包被)

　　原理：聚苯y(tǒng)ixi表面具有疏水性，蛋白質(zhì)在堿性緩沖液(如pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)中會(huì)因疏水相互作用和靜電吸附而被動(dòng)結(jié)合到孔板表面。

　　適用對(duì)象：

　　大多數(shù)蛋白質(zhì)(如抗體、重組抗原、病毒蛋白等)。

　　不能用于小分子(如半抗原、肽段<10個(gè)氨基酸)，因?yàn)樗鼈兾�附能力弱�?/p>

　　(2) 化學(xué)偶聯(lián)(主動(dòng)包被)

　　原理：通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑(如EDC/NHS)將蛋白質(zhì)的氨基(-NH₂)或羧基(-COOH)與微孔板表面的活性基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。

　　適用對(duì)象：

　　小分子抗原(如藥物、激素、短肽)。

　　多糖、脂類(lèi)等不易吸附的分子。

 

 

　　2. 包被的關(guān)鍵步驟

　　(1) 包被緩沖液的選擇

　　常用緩沖液：

　　碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)：最常用，促進(jìn)蛋白質(zhì)吸附。

　　PBS(pH 7.4)：適用于某些對(duì)pH敏感的蛋白。

　　蛋白濃度：通常1-10 μg/mL(需優(yōu)化，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多層吸附，過(guò)低則信號(hào)弱)。

　　(2) 包被條件

　　溫度：

　　4℃過(guò)夜(16-18h)：最穩(wěn)定，蛋白變性風(fēng)險(xiǎn)低。

　　37℃ 1-2h：快速包被，但可能影響某些蛋白活性。

　　體積：每孔50-100 μL(確保完全覆蓋孔底)。

　　(3) 封閉(Blocking)

　　包被后，孔板表面仍存在未結(jié)合位點(diǎn)，需用封閉劑(如BSA、脫脂奶粉、酪蛋白)封閉，防止非特異性結(jié)合。

　　封閉液：1-5% BSA或5%脫脂奶粉(PBS/TBS配制)。

　　封閉時(shí)間：37℃ 1-2h 或 4℃過(guò)夜。

　　3. 影響包被效率的因素

　　因素影響

　　pH堿性(pH 9.6)促進(jìn)蛋白吸附，酸性(pH <7)可能降低吸附效率。

　　離子強(qiáng)度低鹽緩沖液(如碳酸鹽)比高鹽(如PBS)更利于吸附。

　　蛋白性質(zhì)疏水性蛋白吸附更強(qiáng)，親水性蛋白可能需要化學(xué)偶聯(lián)。

　　微孔板材質(zhì)高結(jié)合力板(如Covalink板)適合小分子，普通板適合大分子。

　　溫度和時(shí)間低溫(4℃)長(zhǎng)時(shí)間包被更穩(wěn)定，高溫(37℃)可能加速蛋白變性。

　　4. 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

　　Q1: 包被后信號(hào)弱?

　　可能原因：蛋白濃度過(guò)低、包被時(shí)間不足、緩沖液pH不合適。

　　解決方案：優(yōu)化蛋白濃度(梯度測(cè)試)，延長(zhǎng)包被時(shí)間，調(diào)整緩沖液pH。

　　Q2: 背景高(非特異結(jié)合)?

　　可能原因：封閉不充分、洗滌不徹底、抗體交叉反應(yīng)。

　　解決方案：增加封閉時(shí)間，更換封閉劑(如改用酪蛋白)，優(yōu)化洗滌次數(shù)。

　　Q3: 小分子如何包被?

　　解決方案：采用化學(xué)偶聯(lián)法(如EDC/NHS)或先偶聯(lián)載體蛋白(如BSA-半抗原結(jié)合)。

　　5. 總結(jié)

　　被動(dòng)包被(物理吸附)：適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)單但可能不適合小分子。

　　主動(dòng)包被(化學(xué)偶聯(lián))：適用于小分子抗原，需交聯(lián)劑輔助。

　　封閉是關(guān)鍵：防止非特異結(jié)合，提高信噪比。

　　如果需要特定實(shí)驗(yàn)方案(如抗原包被、抗體檢測(cè)等)，可進(jìn)一步優(yōu)化緩沖體系和包被條件!

　　Elisa板：

　　注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，如需完整版產(chǎn)品信息請(qǐng)咨詢(xún)品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。

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