法鱟試劑使用說(shuō)明書(shū)

法鱟試劑使用說(shuō)明書(shū)

【用途】凝膠法鱟試劑( Gel Clot Tachypleus Amebocyte Lysate, GC TAL) 用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定性檢測(cè)，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。

【原理】該鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品, 鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫度，pH值及無(wú)干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。

【靈敏度】0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 EU/ml 內(nèi)毒素。

【規(guī)格】0.1ml、0.6ml、1.7ml、2.2ml。

【包裝】10支/盒

【貯存】最佳2 - 8ºC, 避光貯存。

【用法】

1. 材料和設(shè)備

1.1試劑：鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

1.2 器材

除熱原試管、除熱原吸頭、或除熱原吸管。

除熱原10×75mm玻璃反應(yīng)試管或除熱原2ml安瓿。

旋渦混合儀、移液器、試管架、定時(shí)器、恒溫水浴箱（37±1℃）。

注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是除熱原的(我公司提供除熱原耗材)。玻璃器皿可經(jīng)250℃干烤至少60分鐘去除熱原。

2. 供試品的預(yù)處理

2.1供試品的pH值應(yīng)在6 - 8之間，若超出此范圍，需用無(wú)熱原緩沖液、0.1N氫氧化鈉或0.1N鹽酸調(diào)節(jié)。

2.2 若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見(jiàn)供試品的【干擾試驗(yàn)】。

2.3若供試品中可能含有β－葡聚糖（β －葡聚糖會(huì)產(chǎn)生G因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素檢測(cè)），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。

實(shí)驗(yàn)操作                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                              

3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)照

3.1.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說(shuō)明書(shū)稀釋，配制 2EU , 1EU , 0.5EU , 及0.25EU的內(nèi)毒素系列(1EU為鱟試劑靈敏度標(biāo)示值)。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)用完。

3.1.2陰性對(duì)照

即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。                                                                                                                                                                                  

3.1.3陽(yáng)性對(duì)照

一般為濃度為2EU 的內(nèi)毒素溶液，一些情況下用以代替內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列。

3.1.4供試品陽(yáng)性對(duì)照

含2EU 內(nèi)毒素的供試品。

3.2鱟試劑的溶解：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解。注意不要引起氣泡，溶解后的試劑應(yīng)在10 min 內(nèi)使用（即配即用）。

3.3 操作步驟

3.3.1 取10×75mm除熱原玻璃試管或除熱原安瓿，加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，內(nèi)毒素，供試品，或陽(yáng)性供試品。各組做2個(gè)平行管。

3.3.2 加入0.1ml鱟試劑。

3.3.3 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37℃的恒溫器中溫育60分鐘，溫育期間避免振動(dòng)。

3.4 結(jié)果判斷

3.4.1 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若管內(nèi)的內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（+）；不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。

3.4.2 只有當(dāng)陰性對(duì)照管結(jié)果均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照管、供試品陽(yáng)性對(duì)照管結(jié)果均為陽(yáng)性，試驗(yàn)方有效，否則無(wú)效。

若陰性對(duì)照管為陽(yáng)性，提示鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、或?qū)嶒?yàn)器具受到污染。

若陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，提示鱟試劑活性減失、內(nèi)毒素效價(jià)降低，鱟試劑的靈敏度或內(nèi)毒素的效價(jià)標(biāo)示不準(zhǔn)確，或內(nèi)毒素的稀釋不正確。

若供試品陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，提示反應(yīng)體系內(nèi)有干擾因素存在。

4. 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

詳見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2010版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)”。

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。

4.1配制 2EU , 1EU , 0.5EU, 及0.25EU的內(nèi)毒素系列，每一濃度4個(gè)平行管，陰性對(duì)照2個(gè)平行管。進(jìn)行凝膠試驗(yàn)，判定結(jié)果。

4.2結(jié)果計(jì)算(以λ= 0.25 EU/ml為例)，見(jiàn)表。

 

平行管f	內(nèi)毒素濃度（EU/ml）					反應(yīng)終點(diǎn)濃度e(EU/ml)	Log10e	∑Log10e ƒ	幾何均數(shù) G (EU/ml)
	2λ	λ	0.5λ	0.25λ
	0.5	0.25	0.125	0.06	0
1	+	+	-	-	-	0.25	-0.602	-0.677	0.21
2	+	+	+	-	-	0.125	-0.903
3	+	+	-	-		0.25	-0.602
4	+	+	-	-		0.25	-0.602

 

 

若鱟試劑靈敏度的測(cè)定值在[0.5 λ- 2 λ]，以標(biāo)示靈敏度 λ為該批鱟試劑的靈敏度。

5.供試品的干擾試驗(yàn)

詳見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2005版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的“干擾試驗(yàn)”。當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、配方、生產(chǎn)工藝改變、或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn), 步驟如下:

5.1 以供試品代替細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為溶劑，配制 2λ, λ, 0.5λ, 及0.25λ 的內(nèi)毒素系列， 進(jìn)行凝膠試驗(yàn)， 判定計(jì)算結(jié)果。

5.2若結(jié)果在 0.5λ 到2λ之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在明顯干擾作用。

5.3若結(jié)果在 0.5λ 到2λ之外，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液存在明顯干擾作用，需對(duì)供試品進(jìn)行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過(guò)最大有效稀釋倍數(shù)MVD)或進(jìn)行其它處理消除干擾。

【批準(zhǔn)文號(hào)】[88]衛(wèi)藥準(zhǔn)字SJ-02號(hào)

【生產(chǎn)企業(yè)】上海一基實(shí)業(yè)有限公司