活性氧 (ROS) 在各類疾病中的作用及其熒光檢測(cè)攻略

大家都曉得 ROS，活性氧嘛......但但但但但是，它可并非是一種單分子，而是一類總稱！那么，ROS 都包含哪些？當(dāng)真集百害而無(wú)一利？與多種疾病相關(guān)的 ROS 又該如何檢測(cè)？？？

Section.01
活性氧 (ROS): 一類總稱

首先，大家所熟知的活性氧—— ROS，并不是單個(gè)分子的名稱，而是含氧原子的高反應(yīng)性化合物的總稱！

如圖 1 所示，ROS 可以是中性分子，如 H₂O₂；離子，如超氧陰離子 O₂•^- ；或自由基，如羥基自由基•OH；當(dāng)然也可以是單線態(tài)氧 ¹O₂ 。其中，羥基自由基•OH 為自由基，其余則為非自由基^[1]。不同 ROS 的形成升高導(dǎo)致分子損傷，稱為“氧化應(yīng)激”。O₂•^- 由 O₂ 還原而成，是其他 ROS 的前體。例如，O₂•^- 分解形成 H₂O₂，H₂O₂ 與亞鐵化合物和相關(guān)還原劑發(fā)生 Fenton 反應(yīng)或 Haber-Weiss 反應(yīng)進(jìn)一步還原為・OH^[2][3]。

圖 1. 活性氧 ROS 的電子式及轉(zhuǎn)換^[2][3]。 
A．活性氧的電子式。超氧陰離子 (O₂•^-)、過(guò)氧化氫 (H₂O₂)、羥基自由基 (•OH) 和單線態(tài)氧 (¹O₂) 的電子式 (從左上到右下)。圖中還顯示了分子氧的電子式以供比較。B. 活性氧反應(yīng)性強(qiáng)，可迅速轉(zhuǎn)換。值得注意的是，超氧陰離子（O₂•^-）是不穩(wěn)定的，在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下會(huì)迅速變成過(guò)氧化氫 (H₂O₂)。如果陰離子與一氧化氮 (NO) 反應(yīng)，則形成過(guò)氧亞硝酸鹽 (ONOO^-)。單線態(tài)氧（¹O₂）可由次氯酸（HOCI）與 H₂O₂ 反應(yīng)生成。

ROS：呼吸作用的副產(chǎn)物

ROS 由各種細(xì)胞區(qū)室產(chǎn)生，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過(guò)氧化物酶體。在這些區(qū)室中，線粒體是 ROS 產(chǎn)生的主要貢獻(xiàn)者，它們產(chǎn)生了大約 90% 的細(xì)胞 ROS (圖 2)^[4][5]。在正常的氧代謝過(guò)程中，ATP 合成會(huì)產(chǎn)生 ROS。因此，在大多數(shù)情況下，ROS 被認(rèn)為是呼吸作用的副產(chǎn)物。

除此之外，內(nèi)源性 ROS 產(chǎn)生的機(jī)制還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)、過(guò)氧化物酶體的代謝反應(yīng)、NADPH 氧化酶 2 系統(tǒng)和酶促反應(yīng)等。當(dāng)然，暴露于某些有害因素，如某些外源性藥物、感染因子、污染、紫外線、香煙煙霧和輻射，也可能導(dǎo)致 ROS 的產(chǎn)生。
 
圖 2. 線粒體活性氧 (ROS) 的主要來(lái)源^[5]。
線粒體呼吸鏈 (MRC) 由四種酶復(fù)合物 (I-IV) 組成。Krebs 循環(huán)中 NADH 和 FADH 2 提供的電子分別在復(fù)合物 I 和 II 處轉(zhuǎn)移，并依次轉(zhuǎn)移至復(fù)合物 III 和 IV。該電子轉(zhuǎn)移與跨內(nèi)膜的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)偶聯(lián)，產(chǎn)生質(zhì)子梯度，從而允許 ADP 通過(guò) ATP 合酶（復(fù)合物 V）進(jìn)行磷酸化。氧代謝產(chǎn)生超氧化物陰離子 (•0₂⁻ )，超氧化物歧化酶 (SOD) 將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫 (H₂O₂)，然后在一些抗氧化酶防御機(jī)制（例如過(guò)氧化氫酶 (CAT) 或谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GPx) 還原酶 (GPr) 系統(tǒng)）的作用下轉(zhuǎn)化為水。過(guò)量的 ROS 產(chǎn)生會(huì)氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或線粒體 DNA (mtDNA)，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡。

“雙刃劍”：ROS 的兩面性

你可能不了解 ROS，但你一定聽(tīng)過(guò)護(hù)膚品的宣傳詞，什么抗老抗氧化，清除自由基，新升級(jí)自由基智感防御…… blabla~~

的確！過(guò)量 ROS 對(duì)身體大有害處。然鵝！在正常的細(xì)胞環(huán)境中，ROS 對(duì)生命至關(guān)重要。

一方面，ROS 具有高反應(yīng)性，很容易與幾乎所有類型的生物分子發(fā)生反應(yīng)。過(guò)量 ROS 通過(guò)氧化生物分子，如細(xì)胞膜脂質(zhì)、組織蛋白質(zhì)或酶、碳水化合物和 DNA 等引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。此外，ROS 可導(dǎo)致多種病理，癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病都顯示出 ROS 參與。另一方面，其參與不同的生物功能，低至中等濃度的 ROS 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮作用。例如通過(guò)氧化還原調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化、離子通道和轉(zhuǎn)錄因子。某些生物合成過(guò)程也需要 ROS，包括甲狀腺激素的產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)的交聯(lián)等^[1][3]。此外，神經(jīng)傳遞、血小板聚集、血壓調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)控制、學(xué)習(xí)和記憶、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、重要生物化合物的合成和外源代謝都與 ROS 有關(guān)。

表 1. 活性氧在各種疾病中的作用^[6]。
 
So！在 ROS 如此熱門的研究態(tài)勢(shì)下，更深入地了解其作用機(jī)制，便是重中之重。Buttttt，活性物質(zhì)嘛，總是難以檢測(cè)，譬如壽命很短，體內(nèi)存在的抗氧化劑種類繁多等。不過(guò)！結(jié)合使用合適的熒光探針，可是測(cè)量 ROS 的一種極好的方法。

Section.02
活性氧 (ROS): 檢測(cè)方案

本部分主要介紹 ROS 的熒光檢測(cè)方法！

不同種類的 ROS 應(yīng)該選取哪種熒光探針？激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)、反應(yīng)物誘導(dǎo)的熒光變化和主要應(yīng)用都有哪些？如表 2 所示，小 M 為大家整理了 23 種熒光探針的相關(guān)信息（可登錄 MCE 官網(wǎng)、公眾號(hào)后臺(tái)私信或聯(lián)系銷售購(gòu)買），大家點(diǎn)贊收藏，按需自取喔~

表 2. 不同熒光探針的 ROS 檢測(cè)方案^[1]。
 
超氧化物自由基（O₂•^-) 檢測(cè)

提到超氧化物 (O₂•^-)，就得先聊聊熒光探針 Dihydroethidium (DHE，又稱 Hydroethidine, HE, HY-D0079)！其主要檢測(cè) O₂•^-。由于 O₂•^- 通常是占比最高的 ROS 成分，DHE 也被廣泛用于 ROS 的檢測(cè)。未氧化形式下，DHE 產(chǎn)生固有的藍(lán)色熒光 (Ex/Em=370/420 nm)，當(dāng) DHE 被 O₂ 氧化時(shí)，產(chǎn)生了一種熒光化合物乙錠 (E⁺)，可嵌入 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，形成乙錠-DNA 復(fù)合物，產(chǎn)生紅色熒光^[1][7]。
 圖 3. Hydroethidine (HE) 和 ethidium (E⁺) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)^[1]。
 

• DHE 實(shí)驗(yàn)指南

實(shí)驗(yàn)步驟^[7]

1. 溶液配制

（1）制備儲(chǔ)存液
用無(wú)水 DMSO 配制 10 mM 的 DHE 儲(chǔ)備液 (1mg DHE 溶于0.317 mL DMSO 中)。

（2）工作液的配置
用預(yù)熱好的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)存液，配制成 1-10 μM 的 DHE 工作液（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整 DHE 工作液的濃度）。

2. 細(xì)胞染色 (懸浮細(xì)胞)

（1）1000 g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL Dihydroethidium 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
（3）4℃，400 g 離心 3-4 分鐘，棄上清。
（4）PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（5）用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3. 細(xì)胞染色 (貼壁細(xì)胞)

（1）將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動(dòng)使其完全覆蓋細(xì)胞，孵育 30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察（若需要用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化重懸后再進(jìn)行染色）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 4A 為 DHE 細(xì)胞染色結(jié)果，檢測(cè)樣本為 U87 細(xì)胞,使用 DHE 5 μM 避光染色 30 min^[8]。 圖 4B-C 為 DHE 組織染色結(jié)果，圖 4B 檢測(cè)樣本為小鼠大腦冰凍切片,使用 DHE 10 μM 避光染色 1 h^[9]。圖 4C 檢測(cè)樣本為小鼠視網(wǎng)膜石蠟切片,使用 DHE 5 μM 避光染色 20 min，設(shè)置了超氧化物歧化酶處理組以驗(yàn)證是否存在非特異干擾^[10]。
 


圖 4. DHE 細(xì)胞和組織染色結(jié)果^[8][9][10]。

熒光探針檢測(cè) H₂O₂

如圖 5 所示，DCFH 氧化生成 DCF，一種熒光化合物，最初被認(rèn)為是檢測(cè)H₂O₂ 的特定指示劑。然而，已經(jīng)證明 DCFH 可以被其他 ROS 氧化。DCFH-DA  (DCFH二乙酸形式, H2DCFH-DA, HY-D0940) 可以應(yīng)用于細(xì)胞研究，因?yàn)樗�能夠通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散，然后被細(xì)胞內(nèi)酯酶酶解成 DCFH。隨后，被多種 ROS 氧化 的 DCFH 生成綠色熒光的 DCF，被廣泛應(yīng)用于總 ROS 的檢測(cè)^[1][11][12]。
 
圖 5. DCFH DA 脫酯化生成 DCFH，以及 ROS 和 RNS 進(jìn)一步氧化生成熒光 DCF 的示意圖^[1]。
 

• H2DCFDA 實(shí)驗(yàn)指南

實(shí)驗(yàn)步驟^[7]

1. 溶液配制

（1） 制備儲(chǔ)存液
用無(wú)水 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA 儲(chǔ)備液 (5 mg 粉末加入 1.026 mL DMSO)。

（2）工作液的配制
用預(yù)熱好的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)存液，配制成 1-10 μM 的 H2DCFDA 工作液（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整 H2DCFDA 工作液濃度，且現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2. 細(xì)胞染色 (懸浮細(xì)胞)

（1）1000 g 離心收集細(xì)胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞后，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察。

3. 細(xì)胞染色 (貼壁細(xì)胞)

（1）將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動(dòng)使其完全覆蓋細(xì)胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察（若需要用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化重懸后再進(jìn)行染色）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 6A 為 DHE 細(xì)胞染色結(jié)果，檢測(cè)樣本為 4T1 細(xì)胞，H2DCFDA 5 μM 避光染色 30 min^[13]。 圖 6B 為 DHE 組織染色結(jié)果，檢測(cè)樣本為活體海馬切片,使用 H2DCFDA 10 μM 避光染色 30 min^[14]。

圖 6. H2DCFDA 細(xì)胞和組織染色結(jié)果^[13][14]。

線粒體超氧化物（O₂•^-) 指示劑

線粒體有氧代謝是 ROS 的主要來(lái)源之一，不過(guò)也有少量 ROS 是NAD(P)H 氧化酶、細(xì)胞色素 P450 單加氧酶等產(chǎn)生的。在研究線粒體相關(guān)疾病機(jī)制，或評(píng)估線粒體靶向藥物效果時(shí)常需要聚焦于單獨(dú)的線粒體 ROS，這該如何是好？

莫慌， MitoSOX Red (HY-D1055) 就能夠避免其他來(lái)源 ROS 的干擾，直接反映線粒體的超氧化物生成狀態(tài)。MitoSOX Red 可以穿透細(xì)胞膜，通過(guò)線粒體膜電位依賴性的方式積聚在線粒體中，并被其中的超氧化物氧化，氧化產(chǎn)物與線粒體核酸結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈熒光 (Ex/Em=510/580 nm)^[15][16]。 
 

• MitoSOX Red 實(shí)驗(yàn)指南

實(shí)驗(yàn)步驟^[15][16]

1. 溶液配制

（1）制備儲(chǔ)存液
用無(wú)水 DMSO 配制 5 mM 的 MitoSOX Red 儲(chǔ)備液 (50 μg 粉末加入 13 μL DMSO)。

（2）工作液的配制
用預(yù)熱好的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基或 PBS 稀釋儲(chǔ)存液，配制成 1-10 μM 的 MitoSOX Red 工作液（請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整 MitoSOX Red 工作液濃度，且現(xiàn)用現(xiàn)配）。

2. 細(xì)胞染色 (懸浮細(xì)胞)

（1）4℃ 1000 g 離心收集細(xì)胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。細(xì)胞密度為 1×10⁶/mL。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）4℃ 400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無(wú)血清培養(yǎng)基或 PBS 重懸細(xì)胞后，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察。

3. 細(xì)胞染色 (貼壁細(xì)胞)

（1）將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)菌蓋玻片上。
（2）從培養(yǎng)基中移出蓋玻片，吸除多余培養(yǎng)基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動(dòng)使其完全覆蓋細(xì)胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養(yǎng)基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察（若需要用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，需將細(xì)胞用胰蛋白酶消化重懸后再進(jìn)行染色）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖 7 為 MitoSOX Red 細(xì)胞染色結(jié)果，檢測(cè)樣本為 Huh7 細(xì)胞,使用 5 μM MitoSOX Red 避光染色 30 min^[17]。
 
圖 7. MitoSOX Red 細(xì)胞染色結(jié)果示例^[17]。

注意事項(xiàng):

• 避光操作：DHE 儲(chǔ)存液、H2DCFDA 儲(chǔ)存液、MitoSOX Red 儲(chǔ)存液建議分裝后在 -20℃ 或 -80℃ 避光保存，避免反復(fù)凍融。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)全程也需要避光操作，溶解、孵育、洗滌和成像需要在暗環(huán)境中進(jìn)行，必要時(shí)可用鋁箔等包裹樣品。
• 含核酸樣本：DHE 的熒光依賴于與核酸的結(jié)合，所以不能用于不含核酸的溶液樣本的 ROS 檢測(cè)。
• 及時(shí)觀察：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 在染色后需要盡快觀察，并且染色后也不可固定細(xì)胞。
• 活細(xì)胞染色：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 只適用于活細(xì)胞染色，DHE 推薦用于未固定的新鮮切片或活細(xì)胞（雖然 DHE 可以嘗試用于固定切片的染色，但是活細(xì)胞染色 DHE 后不可固定細(xì)胞）。
• 也有部分文獻(xiàn)將 DHE 用于石蠟切片，因?yàn)楣潭ú僮鲗?duì) ROS 有一定的影響，固定時(shí)間、染色濃度等條件都需要根據(jù)實(shí)際樣本情況做調(diào)整，總體的染色效果往往也不如未固定的樣本，也有可能難以做出理想的效果，實(shí)在有固定切片染色需要的小伙伴可以參考上面圖 4 的組織染色示例摸索一下，并且建議設(shè)置超氧化物歧化酶處理組等實(shí)驗(yàn)組來(lái)排除可能存在的非特異染色干擾~

產(chǎn)品推薦

HY-D0940，適合活細(xì)胞泛 ROS 檢測(cè)、綠色熒光通道觀測(cè)。

Dihydroethidium (DHE) HY-D0079，適合超氧化物檢測(cè)、紅色熒光通道觀測(cè)、有部分固定切片染色的文獻(xiàn)參考。

MitoSOX Red  HY-D1055，適合靶向線粒體的超氧化物檢測(cè)、橙紅色熒光通道觀測(cè)。

HKPerox-2  HY-D1157，適合活細(xì)胞內(nèi) H2O2 檢測(cè)的高靈敏度綠色熒光探針。

HKGreen-4I  HY-D1148，適合活細(xì)胞內(nèi) ONOO- 檢測(cè)的高靈敏度綠色熒光探針。

HKOH-1 HY-D1151，適合活細(xì)胞內(nèi) •OH 檢測(cè)的高靈敏度綠色熒光探針。

 

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