成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1. 產(chǎn)品基本信息
產(chǎn)品名稱:成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞
產(chǎn)品編號:S-05-005
規(guī)格：(1-1.5)×10^6個(gè)細(xì)胞/管
凍存代次:P5
保存條件:液氮
警告：產(chǎn)品凍存液中含有DMSO，具有潛在的生物公害，操作者請謹(jǐn)慎處理。

2. 產(chǎn)品介紹
成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自成人的恒牙或智齒，是一群存在于牙髓組織中、具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞。成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛、可塑性強(qiáng)、無倫理爭論限制等優(yōu)勢，因此在臨床疾病治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以用于牙周病、牙髓再生、牙體修復(fù)、骨骼或神經(jīng)修復(fù)、皮膚燒傷等疾病治療領(lǐng)域。同時(shí)，成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞可作為細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外的細(xì)胞增殖、移植、分化和免疫調(diào)控研究。

3. 質(zhì)量控制
(1) 本產(chǎn)品經(jīng)過了病毒，細(xì)菌，真菌，支原體。
(2) 本產(chǎn)品經(jīng)過細(xì)胞復(fù)蘇活率，流式鑒定，細(xì)胞周期，生長曲線，倍增時(shí)間，克隆形成率，分化潛能檢測。

4. 產(chǎn)品特性
(1) 本產(chǎn)品復(fù)蘇細(xì)胞活率達(dá)至80%以上。
(2) 操作規(guī)范的條件下，本產(chǎn)品具有良好的傳代能力，至少傳至10代。
(3) 本產(chǎn)品具有較強(qiáng)的分化潛能，能分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。
(4) 流式檢測鑒定（CD73+，CD90+，CD105+）≥95%，（HLA-DR+、CD45+、CD34+）≦2%。
(5) 該產(chǎn)品僅用于科研，不可應(yīng)用于臨床治療或其他方面。

5. 處理原則
(1) 在無菌的條件下處理該產(chǎn)品。
(2) 成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后，建議凍存一部分細(xì)胞作為備份。(3) 建議用于科研的細(xì)胞代次不超過10代。(4) 建議細(xì)胞接種密度是(1.0-1.3)×104個(gè)活細(xì)胞/cm2,具體數(shù)量根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)加以調(diào)整。

6. 成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇
(1) 所需材料 人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基其他選擇培養(yǎng)基，配比如下：100ml DMEM/F12培養(yǎng)基 + (10~15) ml FBS +(1~2ml) 非必須氨基酸 + (1~2ml) L-谷氨酰胺 Phosphate-BufferedSaline（1×PBS）
(2) 復(fù)蘇步驟 從低溫容器中取出凍存管，迅速置于37°C水浴中連續(xù)晃動(dòng)，1min內(nèi)快速解凍； 在無菌條件下，將完全解凍的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有10-15ml細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中； 1500 rpm 離心5 min，吸棄離心后上清； 加入適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率檢測； 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量及活率，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞接種密度為(1.0-1.3)×104個(gè)活細(xì)胞/cm2，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻分布； 在培養(yǎng)器皿上做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至5%CO2、37℃、飽和濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 觀察細(xì)胞狀態(tài)，隔天換液；當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%時(shí)，可進(jìn)行傳代處理。 圖1 已貼壁的成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(40× )

7. 成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代
(1) 所需材料 人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基其他可用培養(yǎng)基，配比如下：100ml DMEM/F12培養(yǎng)基 + (10~15) ml FBS + (1~2ml) 非必須氨基酸 + (1~2ml) L-谷氨酰胺 Phosphate-Buffered Saline（1×PBS） 0.25%胰蛋白酶溶液
(2) 傳代步驟 提前將完全培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶溶液放置室溫。 在無菌條件下，小心吸棄培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基。 用1×PBS清洗細(xì)胞2次，注意操作輕柔，不要損害貼壁細(xì)胞。 加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞(根據(jù)所用培養(yǎng)器皿確定加入量)，室溫靜置消化2-3min，顯微鏡下觀察消化情況。 當(dāng)觀察至80%以上細(xì)胞變圓時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化。 用移液管吸取溶液，反復(fù)吹打培養(yǎng)器皿皿底。吹打時(shí)動(dòng)作輕柔，盡量避免產(chǎn)生氣泡。 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5min。 吸棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)。 調(diào)整細(xì)胞密度為(1.0-1.3)×104個(gè)活細(xì)胞/cm2，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)器皿中，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻分布。 在培養(yǎng)器皿上做好標(biāo)記，轉(zhuǎn)移至5%CO2、37℃、飽和濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)匯合度達(dá)到80-90%時(shí)，可進(jìn)行下一次傳代處理。

8. 成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
(1) 所需材料 成人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基其他可用培養(yǎng)基，配比如下：100ml DMEM/F12培養(yǎng)基 + (10~15) ml FBS + (1~2ml) 非必須氨基酸 + (1~2ml) L-谷氨酰胺 Phosphate-BufferedSaline（1×PBS） 0.25%胰蛋白酶溶液 間充質(zhì)干細(xì)胞凍存液其他可用凍存液配方：90% FBS + 10% DMSO
(2) 凍存步驟 提前將培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶溶液放置室溫。 在無菌條件下，小心吸棄培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基。 用1×PBS清洗細(xì)胞2次，注意操作輕柔，不要損害貼壁細(xì)胞。 加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞(根據(jù)所用培養(yǎng)器皿確定加入量)，室溫靜置消化2-3min，顯微鏡下觀察消化情況。 當(dāng)觀察至80%以上細(xì)胞變圓時(shí)，加入完全培養(yǎng)基終止消化。 用移液管吸取溶液，反復(fù)吹打培養(yǎng)器皿皿底。吹打時(shí)動(dòng)作輕柔，盡量避免產(chǎn)生氣泡。 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5min，同時(shí)取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。 棄離心后上清，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，使用細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為105-106個(gè)/ml，輕輕吹打混勻后分裝至凍存管中，旋緊凍存管蓋。 凍存管做好標(biāo)記，進(jìn)行程序降溫凍存，可選擇凍存盒或程序降溫儀其中一種方式凍存。1) 凍存盒凍存方法：凍存盒直接放于-80℃，第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存；2) 程序降溫儀凍存方法：按照間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)設(shè)程序程序降溫，降溫至-80℃以下后直接將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長期凍存。