DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(20×)

特別提示：包括DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(20×)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(20×)
產(chǎn)品貨號：GL1557
產(chǎn)品規(guī)格：2×3ml|2×10ml

用途：
Western blot、免疫組化中的DAB顯色

注意事項：
主要由DAB孵育液、氧化劑組成，20倍稀釋混合后使用，染色后呈棕色。

儲存條件：-20℃，避光，12個月

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名稱：SDS-PAGE電泳液
貨號：YT619
規(guī)格：1L|10×1L
本品可以用于SDS-PAGE時的電泳緩沖液。使用時每個包裝加蒸餾水溶解，定容到一升即可使用。本電泳緩沖液可以回收，回收后可以再使用1-2次。

注意事項：
1. 配制好的電泳液使用時間不宜超過兩周。
2. 回收的電泳液可以重復(fù)使用，但為了取得最佳的電泳效果，應(yīng)使用沒有使用過的電泳液。

儲存條件：室溫，有效期2年。

名稱：RIPA裂解液(中)
貨號：WE0257
規(guī)格：100ml
  RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的組織以及細胞快速裂解液，主要用于從動物組織和哺乳動物細胞中抽取可溶性蛋白，可用于裂解貼壁細胞和懸浮細胞。按照其裂解液的強度可以分為強、中、弱三類，具體特點和差異請參考附表2，可根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)產(chǎn)品。經(jīng)RIPA裂解液(中)提取的蛋白可應(yīng)用于蛋白定量、Western Blot、IP等檢測分析。
  RIPA裂解液(中)的主要成分為50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑，可以有效抑制蛋白降解。


注意事項：
1、為防止蛋白降解，所有的操作盡量在冰上進行。
2、使用RIPA裂解液得到的蛋白樣品，可采用BCA法進行蛋白定量，以測定蛋白濃度。產(chǎn)品可單獨向本公司訂購，如:WE0276 BCA蛋白定量試劑盒。本品含有高濃度的去垢劑，不能用Bradford法進行蛋白定量。
3、建議在使用RIPA裂解液前，向溶液中加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，以防止蛋白降解，或保持蛋白的磷酸化狀態(tài)。產(chǎn)品可單獨向本公司訂購，如:WE0259 蛋白酶抑制劑混合物，WE0256 磷酸酶抑制劑混合物。
4、若需獲得更高濃度的蛋白，應(yīng)減少哺乳動物蛋白抽提試劑的使用量。
5、對于培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞，推薦先使用常規(guī)方法消化細胞，再參考懸浮細胞蛋白提取步驟操作。
6、對于離心獲得的細胞，若不確定細胞體積，可根據(jù)細胞數(shù)量計算RIPA裂解液的使用量。如5×106個Hela細胞約需加入500μl RIPA裂解液，以此類推。

使用方法：

一、細胞樣品
貼壁細胞蛋白抽提
1、小心傾去貼壁細胞的培養(yǎng)液。
2、可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì)，請先使用預(yù)冷的PBS漂洗細胞。
3、加入適量RIPA Lysis Buffer(Medium)(使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，試劑使用量請參考附表1，在冰上用槍頭吹打貼壁細胞。

表1 貼壁細胞RIPA 裂解液使用量推薦表

細胞培養(yǎng)板類型或培養(yǎng)面積	RIPA 裂解液使用量
100 mm	500-1000μl
60 mm	250-500μl
6孔培養(yǎng)板	200-400μl /孔
24孔培養(yǎng)板	100-200μl /孔
96孔培養(yǎng)板	50-100μl /孔

4、將裂解液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，冰上孵育20分鐘，使細胞充分裂解。
5、14000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。

懸浮細胞蛋白提取
1、懸浮細胞，2,500×g離心5分鐘，棄去上清。
2、可選步驟：若培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì)，請使用PBS漂洗細胞。漂洗后的細胞懸浮液2,500×g離心5分鐘，棄去上清。
3、加入適量RIPA Lysis Buffer(Medium)(使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，每5×106細胞加入約200-500μl RIPA Lysis Buffer(Medium)，吹打均勻。
4、冰上放置20分鐘，使細胞充分裂解。
5、14000×g離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。

二、組織樣品
1、取適當?shù)腞IPA Lysis Buffer(Medium)，在使用前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑。
2、稱量實驗組織的重量，按照1:10(g/ml)的比例加入RIPA Lysis Buffer(Medium)后將組織剪成細小碎片，用電動勻漿器勻漿處理。若需要濃縮的蛋白提取物，可適當減少組織蛋白抽提試劑使用量。
3、冰上孵育20分鐘，使細胞充分裂解。
4、14000×g 離心10分鐘。轉(zhuǎn)移上清液至新管中，進行下一步分析。
注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中可能會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正�，F(xiàn)象。該透明膠狀物為基因組。

表2 蛋白裂解液性能、參數(shù)比較
 

目錄號	WE0258	WE0257
名稱	RIPA裂解液(強)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(弱)	SDS裂解液
裂解強度	強	中	溫和	強
有效裂解成分	1%Triton X-100， 1%脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS	1% NP-40， 0.5%脫氧膽酸鈉 , 0.1% SDS	1% NP-40， 0.25%脫氧膽酸鈉	1%SDS
膜蛋白提取	很好	較好	一般	很好
胞漿蛋白提取	很好	很好	很好	很好
核蛋白提取	很好	較好	較好	很好
主要用途	WB，IP	WB，IP	WB，IP，CO-IP	WB，CHIP

儲存條件：2～8℃