TOP10感受態(tài)細胞

特別提示：包括TOP10感受態(tài)細胞在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：TOP10感受態(tài)細胞
英文名稱：TOP10 Competent Cell
產(chǎn)品貨號：WE0251
產(chǎn)品規(guī)格：100μl×10支

  本產(chǎn)品是大腸桿菌TOP10菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細胞，可用于DNA的熱擊轉化。TOP10是一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株，其φ80lacZΔM15基因產(chǎn)物可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α互補，可用于藍白斑篩選。使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉化效率可達108，適用于高效的質(zhì)粒DNA克隆并能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定復制。

產(chǎn)品組成：

組份	0.1ml×10支
TOP10 Competent Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

實驗前準備及重要注意事項
1、感受態(tài)細胞一定要用干冰運輸。感受態(tài)細胞應在-80℃下保存，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態(tài)細胞的轉化效率。
2、轉化所有步驟均在無菌條件下操作。
3、包裝中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供對照試驗使用。

使用方法：
1、取感受態(tài)細胞置于冰浴中。一次轉化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用。以下實驗以50μl感受態(tài)細胞為例。
2、待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA(根據(jù)實際情況加入適量的DNA，通常100μl感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和)，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。
3、42℃熱擊45秒，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。
4、向每個離心管中加入450μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37℃搖床，150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘使菌體復蘇。
5、根據(jù)實驗需求，取適量已轉化的感受態(tài)細胞，加到含相應抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-16小時。
注意：
1)涂布用量可根據(jù)具體實驗調(diào)整。若轉化的DNA總量較多，可取少量轉化產(chǎn)物涂布平板；若轉化的DNA總量較少，可取200-300μl轉化產(chǎn)物涂布平板。若預計的克隆數(shù)較少，可通過離心(4000rpm，2分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于平板中。
2)新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

儲存條件：-80℃。

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名稱：即用型藍白T載體C型(T7-T3，無MCS)
貨號：BTN120513
規(guī)格：20次
本產(chǎn)品是用Xcm I酶切線性化的DNA片段，其兩個末端的5′都有一個突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐熱酶(如Taq DNA聚合酶)擴增得到的PCR片段。

產(chǎn)品特點：
1. 由于是通過酶切制備，所以載體兩端的帶T率為100%，遠高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端轉移酶在平末端載體加尾得到的T載體。
2. 克隆的陽性率一般在90%以上，縮短了篩選過程。
3. 無Nde I和Nco I等多克隆位點，便于重組基因的克隆
4. 來源于pBlueSoript Ⅱsk(+)，故克隆位點兩側分別有T7和T3 RNA聚合酶啟動子，便于用克隆的PCR片段制備RNA探針。
5.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。
6. T克隆位點位于β-半乳糖苷酶的α肽編碼區(qū)內(nèi)，可以進行藍白斑篩選。
7.含有絲狀噬菌體f1復制起始子，可以制備單鏈DNA。

產(chǎn)品組成：

組分	規(guī)格
即用型藍白T載體C型(10ng/μL)	60μl
陽性對照(35ng/μl)	30μl

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

質(zhì)粒圖譜


名稱：可保種型藍白T載體
貨號：BTN60803
規(guī)格：50 ng
本產(chǎn)品是環(huán)狀的可以制備Clion藍白T載體的質(zhì)粒DNA。T載體是克隆PCR擴增產(chǎn)物的必不可少的工具，但是由于市場上的各種T載體質(zhì)量參差不齊，用戶很難購買到滿意的產(chǎn)品；同時購買的T載體為線性DNA，不能保種，必須反復購買，累計成本很高。為解決這一問題，我司特推出可保種型T載體，用戶只需要購買Xcm I內(nèi)切酶就可以自己制備高質(zhì)量的T載體，隨用隨配，十分方便。

產(chǎn)品特點：
1.一次購買，終身擁有。本產(chǎn)品提供制備T載體用的環(huán)形質(zhì)粒DNA，可以象其他質(zhì)粒一樣保種并長期保存。
2. 隨用隨配，十分方便。用戶只需要提供Xcm I 限制性內(nèi)切酶和基本分子生物學實驗條件，就可以自己制備T載體。整個過程只需要兩天。
3. T載體含T 率為100%。本方法不是使用傳統(tǒng)的加尾法，而是使用Xcm I酶切法。質(zhì)粒的多克隆位點上預先插入了一段長為1.3 Kb的Xcm I DNA片段,經(jīng)Xcm I酶切后回收得到的質(zhì)粒DNA(T載體)兩端自然全部帶有T 突出，比例遠遠高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T載體。
4. 方便各種下游操作。用本產(chǎn)品得到的藍白T載體插入位點兩側有多種常見的酶切位點，便于后續(xù)克��； Xcm I 位點在Alpha 互補區(qū)，可以使用藍白斑篩選重組子；兩邊還有T7和SP6 RNA聚合酶啟動子，便于制備RNA探針。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

使用方法：

一.細菌的轉化
1. 將100μl感受態(tài)細胞于冰上解凍。注意：最好使用end A1菌種(如DH1、DH5、DH5α、JM109、XL1-Blue等。常用宿主細菌的基因型可以參考《分子克隆手冊》等參考書)。因為這類細菌所含DNase少，制備T載體后，殘留的DNase對的T末端的破壞機會更小。
2. 取5-10μl本產(chǎn)品加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。
3. 將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱休克90秒�？焖賹⒐苻D移到冰浴中，使細胞冷卻1～2分鐘。
4. 每管中加900μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。
5. 取100μl培養(yǎng)液涂布到含Amp的LB瓊脂平板表面。
6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16小時后可出現(xiàn)菌落。

二.細菌的鑒定
1. 挑取單個菌落進行過夜細菌培養(yǎng)。
2. 按常規(guī)的方法進行質(zhì)粒小量制備。
3. 用Xcm I內(nèi)切酶按下面條件酶切提取的質(zhì)粒DNA，如果大規(guī)模酶切，需要按比例增加各成分用量:

成分	使用量
Xcm I Buffer,10×	5μl
質(zhì)粒DNA	<或= 2μg
Xcm I	1μl
超純水	加到50μl

 37℃保溫一小時，65℃保溫20分鐘使酶失活。
4.電泳，本產(chǎn)品被Xcm I酶切后將產(chǎn)生3 Kb和1.3 Kb的兩段DNA。
5. 如果Xcm I酶切圖譜正確，則按常規(guī)的方法進行細菌的保種。

三. T載體的制備
1. 參考《分子克隆手冊》等參考書培養(yǎng)細菌和提取質(zhì)粒DNA。注意：一定要去盡可能去除殘留的RNA和蛋白質(zhì)(含殘留DNase)的污染。
2. 用Xcm I酶切質(zhì)粒。注意：酶切時間最好不要超過一小時，避免殘留的DNase對T末端的破壞。
3.電泳后切下含3Kb DNA(既藍白T載體)的膠段。注意：千萬不要用UV照射將要回收的片段，因為UV會使DNA交連，使DNA失去轉化細菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奧萊博綠如藍核酸染料,可以直接在可見光和黑背景下切膠。如果別無選擇，最好在長波(360nm)紫外燈下快速切膠，盡可能切掉多余的凝膠。為避免DNA交連，可以使用百奧萊博的DNA防護劑UV Scavenger(BTN60601)
4. 用常規(guī)DNA回收方法進行膠回收。
5. 測定T載體DNA的濃度后，將T載體DNA保存在-20℃?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?br />
四.連接反應
1. 短暫離心裝有T載體的離心管。
2.在兩個離心管中加入下列成分：

成分	樣品管	陰性對照管
T4 Ligase Buffer，10×	1μl	1μl
藍白T載體	20-50ng	20-50ng
PCR 純化產(chǎn)物	50-500ng	不加
T4 Ligase	3-5U	3-5U
補水到	10μl	10μl

注意: PCR純化產(chǎn)物與藍白T載體的摩爾比最好為3:1-10:1。
3. 用移液器吹打連接反應使之混勻后，16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的操作說明書進行連接)。

五.細菌轉化和鑒定
1. 取5μl連接產(chǎn)物進行轉化，具體步驟見本手冊一，最好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板以便進行藍白篩選。
2. 按經(jīng)典的質(zhì)粒提取+酶切或測序鑒定，可以選用的、在插入位點兩側都有酶切位點的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。按菌落PCR方法篩選，可選用百奧萊博的菌落PCR試劑盒(BTN50901)進行快速篩選，需要T7和SP6 RNA聚合酶啟動子引物。

MCS位點：


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