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目標區(qū)域測序，是將感興趣的基因組區(qū)域定制成特異性探針與基因組DNA進行雜交，將目標基因組區(qū)域的DNA片段進行富集后再利用第二代測序技術進行測序。
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1、Agilent捕獲系統(tǒng)
Agilent SureSelect Target Enrichment System液相捕獲，是基于120 mer的RNA寡核苷酸探針或者叫“baits”。Baits上連接的生物素，可以被鏈霉親和素標記的磁珠吸附�；蚪M片段打斷后，與baits進行雜交，捕獲目標片段。利用磁珠吸附出帶有baits的DNA片段后，進行磁珠洗脫、RNA探針降解，最終獲得目標區(qū)域DNA片段。
圖1 Agilent SureSelect捕獲流程
Agilent提供小鼠（All Exon Mouse, 49.6 Mb）、斑馬魚（All Exon Zebrafish, 75Mb）、牛（All Exon Bovine, 54Mb）的外顯子捕獲芯片，其他物種目標區(qū)域都需要進行目標區(qū)域定制（定制區(qū)域1Kb-24Mb）。
2、NimbleGen捕獲系統(tǒng)
與Agilent的捕獲原理類似，NimbleGen采用DNA探針，以高密度探針著稱，因此價格也相對較高。NimbleGen對指定區(qū)域采用advanced repeat masking方法設計探針，將重復序列區(qū)封閉起來，保證了很好均一性（uniformity）和覆蓋率（coverage）。如下圖所示， NimbleGen利用高密度的50-105 mer的DNA探針來覆蓋目標區(qū)域。
圖2 NimbleGen探針設計示意圖
NimbleGen SeqCap EZ Developer可以根據客戶要求定制目標區(qū)域捕獲探針，能捕獲高達200Mb的目標區(qū)域。另外，還有一些設計好的探針。
表1 NimbleGen SeqCap EZ Developer參數
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型號 |
區(qū)域大小 |
套裝（反應/包裝） |
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SeqCap EZ Developer Library |
Up to 200Mb |
4, 12, 24, 48, 96, 384, 960 |
表2 NimbleGen pre-designed探針
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芯片名稱 |
物種 |
區(qū)域大小 |
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Vertebrate Infecting Viruses |
脊椎動物感染病毒 |
207種病毒 |
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Switchgrass Exome |
柳枝稷 |
50Mb |
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Maise Exome Design |
玉米(B73和Mo17) |
110Mb |
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Barley Exome Design |
大麥 |
88.6Mb |
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Wheat Exome Design |
小麥 |
106.9Mb |
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Soy Exome Desgign |
大豆 |
85.3Mb |
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Mouse Exome Design |
小鼠 |
54.3Mb |
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Pig Exome Design |
豬 |
22.5Mb |
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Canine Exome Design |
犬 |
152Mb |
信息分析內容
■ 對原始數據進行去除接頭、污染序列及低質量 reads的處理；
■ 測序評估（數據比對統(tǒng)計，測序飽和度分析，測序隨機性的統(tǒng)計分析，reads 在參考基因上的分布分析）；
■ SNP、InDel 檢測，注釋和統(tǒng)計；
■ SNP 保守性預測；
■ SNP、InDel 在各基因功能元件上的分布統(tǒng)計。
群體高級信息分析
■ 群體SNP檢測，注釋與統(tǒng)計
■ 群體SNP質控（包含base quality，map quality，allele balance，strand bias，mappability，homopolymer，Hardy-Weinberg Equilibrium測試，InDel附近的SNP過濾）
■ 選擇分析，可選擇方法有：FST，Tajima’s D，θп等
■ GO功能注釋分析，KEGG通路富集分析（可選；GO功能注釋分析默認做，通路富集分析需要基因集基于通路篩選的可做）
