單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

單細(xì)胞測序技術(shù)在2013年被 Nature Methods 評(píng)為年度技術(shù)，被Science評(píng)為年度六大生物類科研熱點(diǎn)的首位，又在2015年登上Science轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)封面。 Nature Methods 將2019年年度技術(shù)又給了單細(xì)胞多組學(xué)。2013年以來基于單細(xì)胞測序技術(shù)獲得了多方面的研究進(jìn)展，文獻(xiàn)發(fā)表也呈現(xiàn)迅猛增長趨勢。即使來源相同的單個(gè)細(xì)胞，由于隨機(jī)生物過程和環(huán)境擾動(dòng)的原因，彼此在許多方面也存在差異，即異質(zhì)性。尤其是腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胚胎發(fā)育期細(xì)胞、干細(xì)胞等最為突出。常規(guī)的組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)不了這一現(xiàn)象帶來的影響，由此研究人員開啟了單細(xì)胞測序技術(shù)的探索之路。

Pubmed收錄“single-cell sequencing”文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)

技術(shù)原理：

       單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序利用GemCode™技術(shù)的微流控技術(shù)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞分選，將帶有條形碼和引物的凝膠珠和單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中；在每個(gè)油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄把凝膠珠的特異性barcode引入到cDNA并用于區(qū)分細(xì)胞；液體油層破壞后，cDNA后續(xù)進(jìn)行文庫構(gòu)建，結(jié)合illumina測序平臺(tái)對(duì)文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，從而達(dá)到在單細(xì)胞水平進(jìn)行表達(dá)測序的目的。10x GenomicsﾠChromium Single Cell單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了單細(xì)胞組學(xué)研究。

實(shí)驗(yàn)流程：

技術(shù)特點(diǎn)：
● 真正意義上的單細(xì)胞檢測（每一個(gè)細(xì)胞形成單獨(dú)的GEM，分別進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記）；
● 超低的單個(gè)細(xì)胞價(jià)格；
● 多細(xì)胞捕獲率低；
● 超高的捕獲效率（單個(gè)細(xì)胞捕獲效率高達(dá)65%）；
● 全自動(dòng)真正單細(xì)胞分離、實(shí)驗(yàn)周期短；
● 超高的細(xì)胞通量（每個(gè)樣本最多可測10000個(gè)細(xì)胞，HT每個(gè)樣本可檢測高達(dá)20000個(gè)細(xì)胞）；
● 細(xì)胞類型多樣化（適宜40μm直徑以內(nèi)，無下限）；
● 通量高（可同時(shí)進(jìn)行8通道檢測，HT可同時(shí)進(jìn)行16通道檢測）。

產(chǎn)品分類：

● 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組
   單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序能夠?qū)Ξ愘|(zhì)群體中的細(xì)胞亞群進(jìn)行全面的研究，追蹤單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，鑒定稀有細(xì)胞類型，有效地解決組織樣本無法破解的細(xì)胞異質(zhì)性難題。
● 單細(xì)胞基因表達(dá)Flex
   單細(xì)胞基因表達(dá)Flex以非常高的靈活性帶來了超高靈敏度的全轉(zhuǎn)錄組分析，樣本在固定的同時(shí)鎖定生物學(xué)狀態(tài)，這樣可以保存脆弱樣本，并且樣本可以大規(guī)模、長時(shí)間、穩(wěn)定的運(yùn)輸。此產(chǎn)品有獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)，探針雜交的同時(shí)可以進(jìn)行樣本標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)多樣本的混樣，在一定程度上降低了成本。樣本在固定后可進(jìn)行長期儲(chǔ)存。在樣本類型上，此產(chǎn)品可兼容FFPE樣本。
● 單細(xì)胞免疫組庫
   單細(xì)胞免疫組庫測序解決了TCR/BCR雙鏈匹配的問題，可以在單細(xì)胞水平完美匹配TCR/BCR雙鏈。
● 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、免疫組庫+表面蛋白
   單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組或免疫組庫能夠?qū)��?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組及免疫組庫進(jìn)行分析，巧妙利用 Feature Barcode技術(shù)及Biolegend配套抗體，同時(shí)檢測表面蛋白表達(dá)變化。
● 單細(xì)胞ATAC-seq
   在單細(xì)胞層面利用改造后活性極高的轉(zhuǎn)座酶切割開放染色質(zhì)區(qū)域，對(duì)此區(qū)域進(jìn)行測序，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究領(lǐng)域的一種高效、簡便的方法。
● 單細(xì)胞ATAC+轉(zhuǎn)錄組測序
   整合單細(xì)胞ATAC測序和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以同時(shí)在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)研究基因表達(dá)和染色質(zhì)開放性。

樣品要求：
● 細(xì)胞總量：細(xì)胞總數(shù)大于5×10⁵個(gè)
● 樣品濃度：7×10⁵-1.2×10⁶cells/mL
● 細(xì)胞活率：大于80%
● 細(xì)胞成團(tuán)率：小于5%
● 細(xì)胞大�。盒∮�40μm
● 細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca²⁺和Mg²⁺等影響酶活性的物質(zhì)
● 組織需解離成單細(xì)胞懸液，植物細(xì)胞需制成原生質(zhì)體

應(yīng)用領(lǐng)域：

數(shù)據(jù)結(jié)果展示：

應(yīng)用案例（一）

CD36+癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌巨噬細(xì)胞遷移抑制因子為肝細(xì)胞癌提供免疫抑制微環(huán)境
影響因子：38.079
發(fā)表時(shí)間：2023.03
發(fā)表期刊：Cell Discovery
原文：CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellularcarcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor

       肝細(xì)胞癌(HCC)是一種具有高度細(xì)胞異質(zhì)性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細(xì)胞類型的多樣性以及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的相互作用仍有待闡明。人類和小鼠HCC腫瘤的單細(xì)胞RNA測序顯示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)的異質(zhì)性�？缥锓N分析發(fā)現(xiàn)CD36+ﾠCAFs表現(xiàn)出高水平的脂質(zhì)代謝和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)表達(dá)。此外，CD36在CD36+ﾠCAFs中通過脂質(zhì)過氧化/p38/CEBPs軸介導(dǎo)氧化性LDL攝取依賴的MIF表達(dá)，CD36+ﾠCAFs以MIF和CD74依賴的方式招募CD33+ﾠ髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)。CD36+ﾠCAFs與HCC細(xì)胞共植入促進(jìn)HCC在體內(nèi)的進(jìn)展。最后，CD36抑制劑與抗PD-1免疫治療協(xié)同作用，通過恢復(fù)HCC中的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。研究者的工作強(qiáng)調(diào)了闡明特定CAF亞群功能在理解腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間相互作用的重要性。
 

應(yīng)用案例（二）
單細(xì)胞免疫組庫測序揭示新冠感染和接種疫苗后BCR的變化
影響因子：19.568
發(fā)表時(shí)間：2022.12
發(fā)表期刊：Emerging Microbes & Infections
原文：Comparative global B cell receptor repertoire difference induced by SARS-CoV-2 infection

       為了研究SARS-CoV-2感染和接種滅活疫苗的健康/感染康復(fù)者之間BCR的動(dòng)態(tài)差異，研究者對(duì)接種過3針滅活疫苗的健康人、接種滅活疫苗的康復(fù)患者、未接種過疫苗的康復(fù)患者進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組+BCR測序，然后與4名感染患者的B細(xì)胞公開數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)BCR的V基因使用率在感染組（無論是否已康復(fù)）比疫苗接種組更顯著。感染后VH基因擴(kuò)增最多的是IGHV3-33，而接種組中擴(kuò)增最多的是IGHV3-23。感染組的BCR克隆性擴(kuò)增和體細(xì)胞超突變均高于健康接種組，感染患者、接種疫苗的健康人和康復(fù)人群共享一小部分公共克隆型。此外，還鑒定了幾種針對(duì)SARS-CoV-2刺突蛋白的公共抗體。這些結(jié)果全面表征了從 SARS-CoV-2 感染到疫苗接種的BCR重鏈和輕鏈配對(duì)庫，為下一代精準(zhǔn)疫苗的開發(fā)提供了進(jìn)一步的指導(dǎo)。
研究背景：
       在SARS-CoV-2感染或疫苗接種后，B細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抗體，在獲得性免疫中起重要作用。在前人研究中，新冠感染或疫苗接種后V基因及免疫球蛋白特征已進(jìn)行過很多研究，但輕重鏈的配對(duì)關(guān)系缺失。因此，本文利用單細(xì)胞免疫組庫測序方法對(duì)不同人群進(jìn)行分析，從單細(xì)胞水平確認(rèn)BCR的特征。
樣品分組：
       1.接種過3針滅活疫苗（BBIBP-CorV）的健康人6例（接種前后均進(jìn)行檢測）；
       2.接種過1針BBIBP-CorV的康復(fù)患者5例；
       3.未接種過BBIBP-CorV的康復(fù)患者5例；
       4.SARS-CoV-2感染患者4例。