SMART | 單細(xì)胞 RNA 測(cè)序

SMART-seq

2012 年，由美國(guó)和瑞典的科學(xué)家共同開(kāi)發(fā)了稱為 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技術(shù) [1]。在 2013 年，Nature Methods 雜志上報(bào)告了新的方案，被稱為 Smart-Seq2[2]，隨后在 2014 年他們有公布了詳細(xì)的操作流程 [3]。獲取單細(xì)胞并裂解細(xì)胞后，含有 oligo-dT 的引物與 mRNA 的 poly- A 結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶到達(dá) mRNA 5’末端時(shí)，MMLV 的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在一鏈 cDNA 的 3'末端增加額外的胞嘧啶，這時(shí) TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 結(jié)合到首鏈末端的胞嘧啶，然后以首鏈 cDNA 為模版進(jìn)行延伸合成互補(bǔ)的第二鏈，全長(zhǎng) cDNA 經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增后進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。

▲SMART-seq2 技術(shù)原理

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1、起始量低：1 個(gè)細(xì)胞起始，適用于難以滿足 10X Genomics 等平臺(tái)起始細(xì)胞量要求的樣本。

2、覆蓋度高： 測(cè)序覆蓋 cDNA 的全長(zhǎng)序列，每個(gè)細(xì)胞能夠獲得上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)。

3、信息個(gè)性化： 除了獲得基因表達(dá)信息，數(shù)據(jù)能夠用于可變剪接，cSNP 等分析，以及帶 poly- A 結(jié)構(gòu)的 lncRNA 研究。

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文庫(kù)結(jié)構(gòu)

圖 SMART-seq2 文庫(kù)示意圖

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建議測(cè)序深度及參數(shù)

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1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來(lái)源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量：?jiǎn)蝹�(gè)細(xì)胞（或微量細(xì)胞）。

4、保存運(yùn)輸：細(xì)胞放入 SMART-seq 試劑盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰運(yùn)輸。