邊緣效應質(zhì)控

邊緣效應質(zhì)控的使用說明

通常做過實時熒光PCR實驗的人們可能會由于實驗結(jié)果的不理想而質(zhì)疑金屬塊熱循環(huán)效果的幾何不均勻性，但是，誰都拿不出確鑿的經(jīng)得起推敲的證據(jù)來證明此點，因為PCR的試劑決定了單管PCR實驗過程是一次性不可逆的過程，也就是說單管PCR實驗過程不可再重復，所以誰都不敢懷疑PCR儀器系統(tǒng)可能存在問題，人們更愿意將實驗結(jié)果出現(xiàn)的問題歸因于手工操作、耗材或者試劑。而我們的專利DNA檢測技術(shù)——四維核酸分子雜交技術(shù)，確可以讓單管檢測過程再三重復，從而可以排除手工操作、耗材或者試劑的影響，檢測出實時熒光PCR儀器是否存在幾何不均勻性，即邊緣效應。

邊緣效應質(zhì)控構(gòu)成：用人工合成的16個堿基DNA片段以及互補的16個堿基DNA片段，一樣的標準比例濃度混合后等體積放入8排管的每一個管中，并加入四維雜交試劑。 蓋好蓋后，將各個管可以單獨分離開來。

實驗安排：由于是人工合成的高純度寡核苷酸，所以，即不需要提取核酸步驟，不會因損失率造成測量誤差；也不需要擴增，不會引起核酸序列失真的現(xiàn)象。將4個管放入金屬塊的A行（或者1列），另外4個管放入金屬塊的H行（或者12列）對稱位置，直接做熔點曲線掃描。然后對稱的互換A行與H行的反應管位置，再做熔點曲線掃描。

熔點曲線程序：PCR儀器軟件應當包含熔解曲線功能，具體程序要求在95ºC保持6分鐘，30ºC保持6分鐘，30ºC至90ºC之間用0.2ºC/秒速度連續(xù)采集熒光數(shù)據(jù)，90ºC保持0秒，然后降溫儀器。

結(jié)果：如果再三對稱的互換A行與H行的反應管位置，再三重復做熔點曲線掃描，得到的結(jié)果都是A行平均熔點值（Tm）比H行的平均值偏高，從未出現(xiàn)過H行平均熔點值（Tm）比A行的平均值高的情況，即存在邊緣效應。

邊緣效應的影響：實時熒光PCR儀的熱循環(huán)金屬塊熔點溫度的不均勻性會造成PCR反應過程中引物與樣本核酸鏈雜交效率不均勻，從而造成PCR的擴增效率不均勻，由于PCR是按指數(shù)倍放大，很小的不均勻性誤差經(jīng)過放大就可能造成質(zhì)的變化，即有可能同樣成份的二份弱陽性標本，同時擴增，出來的結(jié)果可能是一陰性和一陽性。

的使用說明

通常做過實時熒光PCR實驗的人們可能會由于實驗結(jié)果的不理想而質(zhì)疑金屬塊熱循環(huán)效果的幾何不均勻性，但是，誰都拿不出確鑿的經(jīng)得起推敲的證據(jù)來證明此點，因為PCR的試劑決定了單管PCR實驗過程是一次性不可逆的過程，也就是說單管PCR實驗過程不可再重復，所以誰都不敢懷疑PCR儀器系統(tǒng)可能存在問題，人們更愿意將實驗結(jié)果出現(xiàn)的問題歸因于手工操作、耗材或者試劑。而我們的專利DNA檢測技術(shù)——四維核酸分子雜交技術(shù)，確可以讓單管檢測過程再三重復，從而可以排除手工操作、耗材或者試劑的影響，檢測出實時熒光PCR儀器是否存在幾何不均勻性，即邊緣效應。

邊緣效應質(zhì)控構(gòu)成：用人工合成的16個堿基DNA片段以及互補的16個堿基DNA片段，一樣的標準比例濃度混合后等體積放入8排管的每一個管中，并加入四維雜交試劑。 蓋好蓋后，將各個管可以單獨分離開來。

實驗安排：由于是人工合成的高純度寡核苷酸，所以，即不需要提取核酸步驟，不會因損失率造成測量誤差；也不需要擴增，不會引起核酸序列失真的現(xiàn)象。將4個管放入金屬塊的A行（或者1列），另外4個管放入金屬塊的H行（或者12列）對稱位置，直接做熔點曲線掃描。然后對稱的互換A行與H行的反應管位置，再做熔點曲線掃描。

熔點曲線程序：PCR儀器軟件應當包含熔解曲線功能，具體程序要求在95ºC保持6分鐘，30ºC保持6分鐘，30ºC至90ºC之間用0.2ºC/秒速度連續(xù)采集熒光數(shù)據(jù)，90ºC保持0秒，然后降溫儀器。

結(jié)果：如果再三對稱的互換A行與H行的反應管位置，再三重復做熔點曲線掃描，得到的結(jié)果都是A行平均熔點值（Tm）比H行的平均值偏高，從未出現(xiàn)過H行平均熔點值（Tm）比A行的平均值高的情況，即存在邊緣效應。

邊緣效應的影響：實時熒光PCR儀的熱循環(huán)金屬塊熔點溫度的不均勻性會造成PCR反應過程中引物與樣本核酸鏈雜交效率不均勻，從而造成PCR的擴增效率不均勻，由于PCR是按指數(shù)倍放大，很小的不均勻性誤差經(jīng)過放大就可能造成質(zhì)的變化，即有可能同樣成份的二份弱陽性標本，同時擴增，出來的結(jié)果可能是一陰性和一陽性。