細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述

無(wú)菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。

2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操 作。

3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打 開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無(wú)菌水，每周更換)。
5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類︰
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌制品。

1.2. TC 級(jí)培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。

1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml

2. 清洗︰
2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。

3. 滅菌︰
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 oC 水槽中溫?zé)帷?

2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。

3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH 之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無(wú)菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200mlmilli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。
若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，H 會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4 oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。

4. 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群 落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。

抗生素
1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。
1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。
2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制mycoplasma 生長(zhǎng)。
4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。
5. 抗生素使用種類與濃度：工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds

血清
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將40～45 ml 分裝于無(wú)菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20 oC 直接至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較 不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沈淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37 oC 中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37 oC 環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。
7. 血清之生長(zhǎng)測(cè)試
7.1. 材料：
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
7.2. 步驟：
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測(cè)試過(guò)) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80 % confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102 活細(xì)胞數(shù)/ ml。
7.2.3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測(cè)試過(guò)之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。
7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。
7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
7.2.6. 去除固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液，水洗二次。
7.2.9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)
7.2.10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
7.2.11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)：SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
7.4. 訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于–70 oC 保存之

冷凍細(xì)胞活化
1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3. 材料
3.1 37 oC 恒溫水槽
3.2 新鮮培養(yǎng)基
3.3 無(wú)菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步驟：
4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.5 取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO 或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異。
2. 材料：
2.1. 無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以10 ml 分裝于15 ml 無(wú)菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟：
3.1. 附著型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述

無(wú)菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無(wú)菌水，每周更換)。
5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類︰
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌 制品。
1.2. TC 級(jí)培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透 明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml
2. 清洗︰
2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干 凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌︰
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170 oC, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高 壓滅菌121 oC, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 oC 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 oC 水槽中溫?zé)帷?
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳， 可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為 7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成 pH 之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無(wú)菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200mlmilli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合�；旌笕芤褐畃H 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH 會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號(hào)等，貯存于4 oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)

4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。

抗生素
1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素
1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。
1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。
2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制mycoplasma 生長(zhǎng)。
4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。
5. 抗生素使用種類與濃度：
工作濃度. 儲(chǔ)存溫度. 殺滅細(xì)菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds

血清
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 oC，若存放于4 oC，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將40～45 ml 分裝于無(wú)菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %，必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 oC 或–70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20 oC 直接至37 oC 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沈淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有： ytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells andplatelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage celltype。
5. 勿將血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較
不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沈淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37 oC 中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37 oC 環(huán)境下，又會(huì)使此沈淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。一般而言，此
小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。
7. 血清之生長(zhǎng)測(cè)試
7.1. 材料：
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
7.2. 步驟：
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測(cè)試過(guò)) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80% confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1×102 活細(xì)胞數(shù)/ ml。
7.2.3. 將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測(cè)試過(guò)之血清同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。
7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。
7.2.5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。
7.2.6. 去除固定液，水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液，水洗二次。
7.2.9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)
7.2.10. 計(jì)算SPE ( Serum Plating Efficiency )：SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
7.2.11. 計(jì)算RPE(Relative Plating Efficiency)：SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
7.3. 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
7.4. 訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于–70 oC 保存之

冷凍細(xì)胞活化
1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。
2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3. 材料
3.1 37 oC 恒溫水槽
3.2 新鮮培養(yǎng)基
3.3 無(wú)菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步驟：
4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
4.5 取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為
1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO 或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)
1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異。
2. 材料：
2.1. 無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以10 ml 分裝于15 ml 無(wú)菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟：
3.1. 附著型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中