GL261細(xì)胞培養(yǎng)傳代步驟及常見(jiàn)問(wèn)題解決方案
細(xì)胞簡(jiǎn)介
GL261細(xì)胞是于1939年通過(guò)將3-甲基膽蒽顱內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的大腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在20世紀(jì)90年代中期從Gl261腫瘤中建立體外生長(zhǎng)細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道GL261細(xì)胞攜帶TP53和KRAS突變。
細(xì)胞信息
細(xì)胞名稱(chēng)：glioma261小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞
別稱(chēng)：Glioma 261; GLIOMA 261; Glioma-261; GL-261
生長(zhǎng)特性：成纖維細(xì)胞樣、貼壁生長(zhǎng)
倍增時(shí)間：~100-120小時(shí)（DSMZ=ACC-802）
細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM（高糖）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（貨號(hào)：ZQ0500）+1%ps（貨號(hào)：CSP006）
溫度：37℃
換液頻次：2~3次/周
傳代比例：1:2-1:4（具體情況視實(shí)際細(xì)胞量決定）
細(xì)胞特性：該細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)過(guò)程中有漂浮細(xì)胞。
傳代步驟
吸液：吸出原培養(yǎng)液;
潤(rùn)洗：加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄;
加酶：加入1mL左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞;
消化：放入培養(yǎng)箱消化，顯微鏡下看到細(xì)胞回縮細(xì)胞變圓、有明顯間隙（約2-4min），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶（皿），細(xì)胞大部分脫落時(shí)直到80%脫落可終止，加入3-5mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞3-8下培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落；
離心：收集細(xì)胞懸液到離心管進(jìn)行離心，1000rpm/min 5分鐘，離心完吸出上清丟棄；
加培養(yǎng)基：加入新鮮培養(yǎng)基，按比例接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，畫(huà)8字法混勻細(xì)胞，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，后續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
常見(jiàn)問(wèn)題
1、當(dāng)你的細(xì)胞收到是如下?tīng)顟B(tài)時(shí)，該如何處理?
運(yùn)輸會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞皺縮，脫落、聚集等情況，當(dāng)收到細(xì)胞皺縮、脫落時(shí)，可以先噴酒精，擦拭干凈細(xì)胞瓶表面。放入培養(yǎng)箱靜止2-4h,一般靜置后細(xì)胞會(huì)恢復(fù)，細(xì)胞會(huì)再次貼壁。在密度沒(méi)有達(dá)到80%的時(shí)候可以把培養(yǎng)基吸出。添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，次日觀察。當(dāng)細(xì)胞密度有80%以上且部分細(xì)胞堆積時(shí)，可按照上面步驟進(jìn)行傳代，一般傳代后細(xì)胞會(huì)恢復(fù)。
2、培養(yǎng)過(guò)程中有碎片、黑點(diǎn)變多、液體變濃稠
GL261細(xì)胞具有達(dá)爾頓抗原neu轉(zhuǎn)化基因，p815蛋白質(zhì)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤密切相關(guān)，p185與表皮生長(zhǎng)因子受體在血清受體血學(xué)上相似，具有分泌功能，分泌物質(zhì)是濃稠的1.1、所以細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基會(huì)變濃稠，換液時(shí)能明顯感受到液體會(huì)有拉絲的情況，特別是細(xì)胞密度高換液時(shí)候較明顯。
2.1細(xì)胞凋亡后會(huì)產(chǎn)生一些分泌物的沉積和碎片物質(zhì)，在顯微鏡下呈黑點(diǎn)狀。屬于正�，F(xiàn)象；
2.2 該細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中始終有少量漂浮的細(xì)胞及碎片，背景中可看到少量黑點(diǎn)，換液可暫時(shí)改善，但繼續(xù)培養(yǎng)漂浮細(xì)胞仍會(huì)出現(xiàn)。這是細(xì)胞特性無(wú)法避免。以上都是常見(jiàn)現(xiàn)象，不影響細(xì)胞增殖和實(shí)驗(yàn)；
3、生長(zhǎng)緩慢
細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢時(shí)，可以提高5-10%血清濃度（血清總濃度不超過(guò) 20%）培養(yǎng)一段時(shí)間，待細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)速度恢復(fù)正常后換回正常血清濃度。
4、漂浮細(xì)胞太多
該細(xì)胞貼壁展開(kāi)較慢，個(gè)體較大，復(fù)蘇、傳代24h后大部分細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或圓形，細(xì)胞形態(tài)未完全展開(kāi)，此時(shí)不用換液處理，48h后可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始成片聚集生長(zhǎng)；新復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，可見(jiàn)較多漂浮，復(fù)蘇48h內(nèi)可先不換液，保留漂浮細(xì)胞繼續(xù)貼壁；如果傳代后貼壁細(xì)胞少，或貼壁不牢固，可購(gòu)買(mǎi)纖連蛋白或多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)瓶輔助細(xì)胞貼壁。
消化傳代時(shí)，把控好消化時(shí)間。吹打細(xì)胞注意盡量輕柔，不要產(chǎn)生過(guò)多氣泡以免造成細(xì)胞碎裂增多。
GL261細(xì)胞是于1939年通過(guò)將3-甲基膽蒽顱內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的大腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在20世紀(jì)90年代中期從Gl261腫瘤中建立體外生長(zhǎng)細(xì)胞。文獻(xiàn)報(bào)道GL261細(xì)胞攜帶TP53和KRAS突變。
細(xì)胞信息
細(xì)胞名稱(chēng)：glioma261小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞
別稱(chēng)：Glioma 261; GLIOMA 261; Glioma-261; GL-261
生長(zhǎng)特性：成纖維細(xì)胞樣、貼壁生長(zhǎng)
倍增時(shí)間：~100-120小時(shí)（DSMZ=ACC-802）
細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM（高糖）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZQ-100）+10%FBS（貨號(hào)：ZQ0500）+1%ps（貨號(hào)：CSP006）
溫度：37℃
換液頻次：2~3次/周
傳代比例：1:2-1:4（具體情況視實(shí)際細(xì)胞量決定）
細(xì)胞特性：該細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、培養(yǎng)過(guò)程中有漂浮細(xì)胞。
傳代步驟
吸液：吸出原培養(yǎng)液;
潤(rùn)洗：加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄;
加酶：加入1mL左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞;
消化：放入培養(yǎng)箱消化，顯微鏡下看到細(xì)胞回縮細(xì)胞變圓、有明顯間隙（約2-4min），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶（皿），細(xì)胞大部分脫落時(shí)直到80%脫落可終止，加入3-5mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞3-8下培養(yǎng)瓶使細(xì)胞全部脫落；
離心：收集細(xì)胞懸液到離心管進(jìn)行離心，1000rpm/min 5分鐘，離心完吸出上清丟棄；
加培養(yǎng)基：加入新鮮培養(yǎng)基，按比例接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，畫(huà)8字法混勻細(xì)胞，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，后續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
常見(jiàn)問(wèn)題
1、當(dāng)你的細(xì)胞收到是如下?tīng)顟B(tài)時(shí)，該如何處理?
運(yùn)輸會(huì)導(dǎo)致該細(xì)胞皺縮，脫落、聚集等情況，當(dāng)收到細(xì)胞皺縮、脫落時(shí)，可以先噴酒精，擦拭干凈細(xì)胞瓶表面。放入培養(yǎng)箱靜止2-4h,一般靜置后細(xì)胞會(huì)恢復(fù)，細(xì)胞會(huì)再次貼壁。在密度沒(méi)有達(dá)到80%的時(shí)候可以把培養(yǎng)基吸出。添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，次日觀察。當(dāng)細(xì)胞密度有80%以上且部分細(xì)胞堆積時(shí)，可按照上面步驟進(jìn)行傳代，一般傳代后細(xì)胞會(huì)恢復(fù)。
2、培養(yǎng)過(guò)程中有碎片、黑點(diǎn)變多、液體變濃稠
GL261細(xì)胞具有達(dá)爾頓抗原neu轉(zhuǎn)化基因，p815蛋白質(zhì)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤密切相關(guān)，p185與表皮生長(zhǎng)因子受體在血清受體血學(xué)上相似，具有分泌功能，分泌物質(zhì)是濃稠的1.1、所以細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基會(huì)變濃稠，換液時(shí)能明顯感受到液體會(huì)有拉絲的情況，特別是細(xì)胞密度高換液時(shí)候較明顯。
2.1細(xì)胞凋亡后會(huì)產(chǎn)生一些分泌物的沉積和碎片物質(zhì)，在顯微鏡下呈黑點(diǎn)狀。屬于正�，F(xiàn)象；
2.2 該細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中始終有少量漂浮的細(xì)胞及碎片，背景中可看到少量黑點(diǎn)，換液可暫時(shí)改善，但繼續(xù)培養(yǎng)漂浮細(xì)胞仍會(huì)出現(xiàn)。這是細(xì)胞特性無(wú)法避免。以上都是常見(jiàn)現(xiàn)象，不影響細(xì)胞增殖和實(shí)驗(yàn)；
3、生長(zhǎng)緩慢
細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢時(shí)，可以提高5-10%血清濃度（血清總濃度不超過(guò) 20%）培養(yǎng)一段時(shí)間，待細(xì)胞狀態(tài)和生長(zhǎng)速度恢復(fù)正常后換回正常血清濃度。
4、漂浮細(xì)胞太多
該細(xì)胞貼壁展開(kāi)較慢，個(gè)體較大，復(fù)蘇、傳代24h后大部分細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形或圓形，細(xì)胞形態(tài)未完全展開(kāi)，此時(shí)不用換液處理，48h后可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始成片聚集生長(zhǎng)；新復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞，可見(jiàn)較多漂浮，復(fù)蘇48h內(nèi)可先不換液，保留漂浮細(xì)胞繼續(xù)貼壁；如果傳代后貼壁細(xì)胞少，或貼壁不牢固，可購(gòu)買(mǎi)纖連蛋白或多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)瓶輔助細(xì)胞貼壁。
消化傳代時(shí)，把控好消化時(shí)間。吹打細(xì)胞注意盡量輕柔，不要產(chǎn)生過(guò)多氣泡以免造成細(xì)胞碎裂增多。
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