MSCs分化為脂肪細(xì)胞

試劑和材料：
完全培養(yǎng)基（CCM）：α-MEM：α-低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無(wú)核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存于4℃，不超過(guò)2周；
FDM（脂肪分化培養(yǎng)基）：①FDM：CCM包含0.5μmol/L IBMX，50μmol/mlIM和0.5μmol/L地塞米松。②異丁基甲基黃嘌呤（IBMX），1000×儲(chǔ)存液，用甲醇配制成0.5mmol/L。③吲哚美辛（IM）：1000×儲(chǔ)存液，用甲醇配制成50mmol/L。④地塞米松：1000×儲(chǔ)存液，用水配制成0.5mmol/L；
PBSA；
胰蛋白酶/EDTA；
聚丙烯離心管，15ml和50ml；
組織培養(yǎng)皿，6孔，孔面積為9.6cm2；
0.85%臺(tái)盼藍(lán)鹽溶液；
中性福爾馬林緩沖液，10%；
ORO工作液：ORO用異丙醇配制成1%，3份。PBSA，2份。70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾；
改良的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器；

實(shí)驗(yàn)方法：
從單層細(xì)胞中收集MSCs；
向6孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入2ml CCM，共有1×105個(gè)細(xì)胞（適用于人或大鼠）。最終密度約1×103個(gè)細(xì)胞/cm2；
將上排3個(gè)孔標(biāo)記為“成脂”，下排3個(gè)孔標(biāo)記為“陰性”；
在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到7.%—80%匯合；
達(dá)到所需的細(xì)胞密度時(shí)，從孔中吸出完全樣機(jī)，向6孔培養(yǎng)板上排的孔中加入2ml FDM，向下排的孔中加入2ml CCM；
在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。ORO檢測(cè)時(shí)，于21天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色；
從培養(yǎng)箱中取出分化后的MSCs，每孔中的單層細(xì)胞用2ml PBSA潤(rùn)洗兩次；
每孔中加入2ml福爾馬林，室溫固定單層細(xì)胞10min；
吸出福爾馬林，每孔中加入2ml PBSA潤(rùn)洗兩次后，再用2ml蒸餾水潤(rùn)洗一次；
加入2ml ORO工作液，室溫孵育30min；
過(guò)量PBSA潤(rùn)洗各孔，直到“陰性”孔中的背景染色最大限度地清除；
用顯微鏡觀察標(biāo)記為“成脂”的單層細(xì)胞評(píng)價(jià)脂滴的染色程度。成脂分化達(dá)到令人滿意的水平時(shí)，單層細(xì)胞ORO著色面積超過(guò)30%。此時(shí)，單層細(xì)胞可在4℃ PBSA中最多存放7天。或者，將ORO從著色的單層細(xì)胞中提取出來(lái)，用先前描述的方案進(jìn)行測(cè)定；