原代細(xì)胞培養(yǎng)純化方法全面解析

原代細(xì)胞培養(yǎng)純化是細(xì)胞生物學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟，旨在從組織中分離并獲得高純度的特定細(xì)胞類型，為后續(xù)實驗提供可靠的材料。原代細(xì)胞培養(yǎng)純化的作用原理主要圍繞抑制非目標(biāo)細(xì)胞生長、促進(jìn)目標(biāo)細(xì)胞選擇性增殖。

原代細(xì)胞培養(yǎng)純化需結(jié)合實驗?zāi)康暮图?xì)胞類型選擇合適的方法。操作過程中需嚴(yán)格無菌、優(yōu)化消化條件、檢測細(xì)胞活性，并監(jiān)控污染。通過綜合運(yùn)用多種方法，可獲得高純度、高活性的原代細(xì)胞，為后續(xù)實驗提供可靠材料。

我們在介紹原代細(xì)胞純化前需要了解原代培養(yǎng)的概念，因為很多小伙伴很容易分不清原代培養(yǎng)與原代細(xì)胞的概念：

原代培養(yǎng)（primary culture），通俗地講，就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。
 

1.  原代培養(yǎng)的實質(zhì)是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)器皿；

2.  原代培養(yǎng)中的『代』并不是指細(xì)胞的『代』數(shù)； 

3.  原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)基；

4.  植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)有時候在培養(yǎng)物增長到一定程度后，也需要移植培養(yǎng)物到新的器皿再培養(yǎng)。

原代細(xì)胞（primary culture cell）是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。

原代細(xì)胞培養(yǎng)純化的主要方法：

1、機(jī)械分離法

◆原理：利用物理方法（如切割、刮除）分離目標(biāo)細(xì)胞。

◆應(yīng)用：適用于組織塊較大、細(xì)胞分布不均的情況，如從器官中分離特定區(qū)域細(xì)胞；適用于多種類型細(xì)胞明顯成片區(qū)生長，區(qū)域細(xì)胞純度較高。

◆操作：在顯微鏡下手動分離目標(biāo)組織區(qū)域，避免混入其他細(xì)胞類型；在顯微鏡下觀察，用記號筆在細(xì)胞培養(yǎng)瓶上勾畫出雜細(xì)胞的分布區(qū)域，然后用細(xì)胞刮刀伸入瓶內(nèi)，刮除雜細(xì)胞，保留目標(biāo)細(xì)胞（常用于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞交錯成塊分布）。

√ 優(yōu)點：操作簡單，成本低。

× 缺點：對細(xì)胞機(jī)械損傷較大，分離效果可能不如酶消化法。

2、酶消化法

◆原理：使用胰蛋白酶、膠原酶等酶類消化組織，如膠原酶，特異性降解纖維化組織的膠原蛋白、消化腫瘤組織塊，破壞來自間質(zhì)的成纖維細(xì)胞，可獲得較純的癌細(xì)胞；中性蛋白酶，切割細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白和層粘連蛋白，釋放單細(xì)胞。

◆應(yīng)用：廣泛用于貼壁細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞），適用于纖維化組織（如胰腺、肝臟）、腫瘤組織、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分離。

◆操作：將組織剪碎后，加入適量酶液消化，通過控制消化時間和溫度，使目標(biāo)細(xì)胞脫離組織，

同時避免消化過度。

√ 優(yōu)點：分離效率高，細(xì)胞活性好。

× 缺點：酶的成本較高，消化時間及效果難以控制，且可能對某些細(xì)胞類型有毒性。

3、差速貼壁分離法

◆原理：利用不同種類細(xì)胞貼壁速度差異性及細(xì)胞敏感性不同，通過控制培養(yǎng)時間差或消化時間差，可選擇性移除未貼壁或弱貼壁的細(xì)胞，從而分離目標(biāo)細(xì)胞。

◆應(yīng)用：成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶作用敏感，組織塊或消化傳代時，成纖維細(xì)胞常常先脫落；原代細(xì)胞懸液接種后，成纖維細(xì)胞貼壁速度比上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞快。

◆操作：將剛從組織分散的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，0.5-2h后，吸取未貼壁細(xì)胞懸液，一般先貼壁細(xì)胞為成纖維類細(xì)胞，未貼壁懸液多為上皮類細(xì)胞。

√ 優(yōu)點：無需特殊試劑，操作簡單。

× 缺點：分離周期長，純度可能有限。

4、化學(xué)試劑抑制法

◆原理：利用增殖期細(xì)胞的作用敏感性，通過抑制雜細(xì)胞增殖，從而避免少量雜細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞，拉大目的細(xì)胞與雜細(xì)胞優(yōu)劣勢差而分離目標(biāo)細(xì)胞。

有些化學(xué)物質(zhì)對成纖維細(xì)胞的生長有抑制作用，而對培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞無明顯影響。因此，在細(xì)胞貼壁生長或分裂后，利用這些化學(xué)物質(zhì)抑制成纖維細(xì)胞生長，從而獲得純度較高的目標(biāo)細(xì)胞。

 如阿糖胞苷通過抑制細(xì)胞DNA的合成，干擾細(xì)胞的增殖；嘌呤霉素作為蛋白合成抑制劑，能抑制細(xì)胞的生長。

◆應(yīng)用：阿糖胞苷在神經(jīng)元、心肌等不增殖細(xì)胞；嘌呤霉素在微血管內(nèi)皮細(xì)胞等貼壁增殖緩慢的細(xì)胞純化作用。

◆操作：將剛從組織分離出來的神經(jīng)元細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，同時加入合適濃度的藥物篩選，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，藥物作用2-5d后更換新鮮培養(yǎng)基。

√ 優(yōu)點：操作簡便，成本較低，特定細(xì)胞類型效果明顯，可與其他方法聯(lián)合使用。

× 缺點：細(xì)胞損傷風(fēng)險較高，純化效果有限，過程不可控，批次差異大，結(jié)果不穩(wěn)定，可能影響細(xì)胞功能。

5、密度梯度離心法

◆原理：利用不同細(xì)胞類型的密度差異，通過離心分層。

◆應(yīng)用：適用于血液細(xì)胞等單細(xì)胞懸液（如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞）的分離。

◆操作：將細(xì)胞懸液疊加于密度梯度介質(zhì)（如Ficoll）上，離心后不同細(xì)胞層分布在不同介質(zhì)層中，收集目標(biāo)細(xì)胞層。

 

 

√ 優(yōu)點：分離純度高，適用范圍廣。

× 缺點：離心時間長，對操作技能要求較高。

6、免疫磁珠分選法

◆原理：利用特異性抗體標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，通過磁場分離。

◆應(yīng)用：高純度分離特定細(xì)胞亞群（如CD4+ T細(xì)胞、干細(xì)胞）。

◆操作：將細(xì)胞與磁珠標(biāo)記的抗體孵育，通過磁場分離標(biāo)記細(xì)胞，未標(biāo)記細(xì)胞被去除。

√ 優(yōu)點：分離純度高，可達(dá)99%以上。

× 缺點：設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，成本較高。

7、流式細(xì)胞術(shù)分選法

◆原理：利用熒光標(biāo)記抗體，通過流式細(xì)胞儀識別并分離目標(biāo)細(xì)胞。

◆應(yīng)用：高精度、高純度分離細(xì)胞亞群（如腫瘤干細(xì)胞、免疫細(xì)胞）。

◆操作：將細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗體孵育，通過流式細(xì)胞儀分析并分選目標(biāo)細(xì)胞。

√ 優(yōu)點：分離效率高，細(xì)胞活性好、純度高，分析參數(shù)多、數(shù)據(jù)全面。

× 缺點：儀器價格昂貴，操作技術(shù)門檻高，細(xì)胞容易損傷。

8、專用培養(yǎng)基及相關(guān)因子組合篩選法

◆原理：原代細(xì)胞的培養(yǎng)成功高度依賴于專用培養(yǎng)基和關(guān)鍵生長因子的優(yōu)化組合；不同細(xì)胞類型對營養(yǎng)成分（如葡萄糖、氨基酸）、激素（如胰島素）、細(xì)胞因子（如EGF、bFGF）的需求各異；因此需要系統(tǒng)篩選和優(yōu)化培養(yǎng)體系來模擬目的細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境（如膠原蛋白、層粘連蛋白），促進(jìn)細(xì)胞貼附、增殖或分化。

信號通路調(diào)控生長因子：通過激活特定通路（如EGF→EGFR→MAPK）促進(jìn)增殖或分化；劑量依賴性：低濃度可能無效，高濃度可能誘導(dǎo)異常分化（如TGF-β在腫瘤中的作用）

◆應(yīng)用：廣泛用于原代細(xì)胞篩選。如神經(jīng)元細(xì)胞：添加B27維持神經(jīng)特性；干細(xì)胞：添加bFGF維持干性；腫瘤細(xì)胞：提供高糖和谷氨酰胺支持瓦氏效應(yīng)（Warburg effect）；血管內(nèi)皮細(xì)胞：需要包被培養(yǎng)皿，促進(jìn)細(xì)胞貼附、增殖，添加VEGF促進(jìn)血管分化。

◆操作：依據(jù)細(xì)胞增殖分化特性及信號通路需求，選擇合適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加相關(guān)生長因子，定制專用完全培養(yǎng)基。

 

√ 優(yōu)點：提高細(xì)胞存活率，減少批次變異，適用于臨床級細(xì)胞實驗，精準(zhǔn)控制細(xì)胞代謝行為。

× 缺點：研發(fā)配制價格昂貴，測試驗證周期長，因子添加劑價格昂貴。
 

在實際操作中，剛分離出的原代細(xì)胞往往純度較低，且雜細(xì)胞種類多；后期接種培養(yǎng)時，需要根據(jù)目的細(xì)胞及雜細(xì)胞的特性和實時狀態(tài)，運(yùn)用多種純化方法結(jié)合去培養(yǎng)純化，才能達(dá)到高純度、高活性的目的原代細(xì)胞。