Cultex細胞暴露技術建立呼吸道過敏反應的人肺體外模型
方法簡介
化學品引起的呼吸道過敏反應，不論是體內(nèi)還是體外，目前尚缺少有效的評價方法。因此，新實驗方法的開發(fā)收到極大的關注，特別是考慮到REACH（《化學品注冊、評估、許可和限制》）新的法規(guī)規(guī)定。應注意的是，REACH指導方針明確指出，應盡量避免動物實驗，其中，化妝品材料應在2013年全面禁止動物實驗。所以，建立體外模型顯得非常必須和十分的緊迫。
為了化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型的建立，我們采用Cultex技術開發(fā)一種三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬人肺肺泡區(qū)。該系統(tǒng)，采用細胞氣液界面暴露技術，使體外培養(yǎng)的細胞在完全模擬人肺部環(huán)境下暴露于氣溶膠或顆粒物質(zhì)。
方法
建立三種類型的共培養(yǎng)系統(tǒng)：
雙細胞共培養(yǎng)模型：
•人肺上皮細胞（ECs）：A549細胞
•人肺泡巨噬細胞（AMs）：U937細胞
三細胞共培養(yǎng)模型，類型1和類型2：
• ECs: A549 cells
• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA
• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes
ECs種在BD細胞培養(yǎng)插件上，培養(yǎng)7天。形成上皮細胞層后，AMs種在ECs層上。對于三細胞共培養(yǎng)類型1，DCs培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)插件上（如圖1A）；對于三細胞共培養(yǎng)類型2，DC細胞種在上皮層內(nèi)側（如圖1B）。
細胞培養(yǎng)的終點特征：
• EC層完整性：用Millicel-ERS (Millipore)測量跨上皮電阻（TEER）。
• EC層功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。
• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86
使用體外暴露染毒系統(tǒng)（Cultex）的共培養(yǎng)模型對呼吸敏化劑和刺激物進行暴露染毒實驗。
結果
TEER測量：電阻值隨著時間增加。最高值出現(xiàn)在第7天（紅色箭頭），此時對插件進行處理（圖.2）。
圖 2: 每個值是3個腔室內(nèi)測量的標準偏差平均值。
Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C產(chǎn)物，用免疫化學染色方法所示（圖.3A）。作為陰性對照，AMs沒有染色陽性proSP-C (圖. 3B)。使用免疫化學染色方法（圖.3C）和流式方法（圖.3D）分析未成熟的DCs。兩種方法表明，培養(yǎng)的DC具有CD86/CD83陰性表達。流式表明DC-marker CD1a細胞呈陽性（圖.3D）。
圖3：免疫細胞化學（A-C）和流式（D）的表面標記。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（藍色信號）和抗-proSP-C（紅色）。在ECs上檢測到ProSP-C，但是在AMs上檢測不到。C：DCs DAPI染色（藍色信號）和CD86（紅色）。大部分細胞CD86呈陰性（箭頭）。 D：DCs流式分析。
討論
以上是采用Cultex體外細胞暴露技術建立化學品呼吸道過敏反應的人肺體外模型。這種復雜三維細胞共培養(yǎng)體統(tǒng)的使用，我們能夠鑒定生物標記物的呼吸道過敏反應。由于體外暴露技術可以直接使用粉末狀顆粒物，不必要求必須具有水溶性特征，所以這一方法可擴展適用各種化學品。
關于Cultex
Cultex Laboratories GmbH 于2007由Ulrich Mohr教授與Michaela Aufderheide教授為了推進其在體外毒理領域的研究而成立。在有關空氣、揮發(fā)性化合物和復雜混合物的體外暴露分析方面的最尖端的研究、開發(fā)與實施方面，兩位創(chuàng)始人都有著出色的業(yè)績，而且特別注重 “真實”的暴露環(huán)境。
Cultex專注于體外暴露的毒理研究，擁有CULTEX體外暴露模塊的技術專利，并根據(jù)研究的進展不斷改進并優(yōu)化體外暴露實驗設備及技術。目前已有CULTEX RFS等模塊投入到各種體外毒理相關的科研項目之中。依托側重于吸入毒理的體外毒理學新技術的發(fā)展，Cultex亦為其客戶提供全面的服務，范圍涵蓋咨詢、規(guī)劃和實施。
Cultex細胞暴露技術三層結構 最先進的Cultex RFS細胞暴露模塊
關于佰樂良成科技
北京佰樂良成科技有限公司自2010年成立于北京，是一家專注于毒理學研究領域的高科技企業(yè)，主要致力于向用戶提供國際領先的毒理學研究設備，以及暴露染毒、毒理分析、毒性評估等一系列整體解決方案的服務。目前，北京佰樂良成科技有限公司已成為國內(nèi)最專業(yè)的毒理儀器設備與整體方案供應商。
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