單細(xì)胞分析揭示C1q-high單核細(xì)胞對(duì)貝赫切特病的促炎作用

貝赫切特�。˙ehcet’s disease，BD），又名白塞病，是一種慢性血管炎，通常表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性口腔/生殖器潰瘍和皮膚病變，以全身免疫異常為特征。然而，目前還缺乏對(duì)BD發(fā)病機(jī)制的全面了解。研究者對(duì)BD患者和健康供血者的外周血單個(gè)核的細(xì)胞(PBMCs) 進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序和Bulk RNA測(cè)序并對(duì)分離出的單核細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序。研究者觀察到BD患者外周血單個(gè)核的細(xì)胞中單核細(xì)胞不僅在數(shù)量上會(huì)顯著增加而且細(xì)胞內(nèi)部也存在明顯的轉(zhuǎn)錄變化。數(shù)據(jù)分析顯示，BD中C1q-high單核細(xì)胞(C1qhi)顯著富集；擬時(shí)序分析表明，BD單核細(xì)胞明顯地將其分化向伴隨炎癥和C1qhi單核細(xì)胞的軌跡轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，C1qhi單核細(xì)胞可增強(qiáng)吞噬和促炎細(xì)胞因子分泌，并且該亞型具有顯著的臨床相關(guān)性。在機(jī)制上，激活的干擾素-γ (IFN-γ)信號(hào)在BD患者中誘導(dǎo)C1qhi單核細(xì)胞增多，而tofacitinib治療可使C1qhi單核細(xì)胞減少。該研究闡明了BD的免疫情況和C1qhi單核細(xì)胞對(duì)BD炎癥增加的重要性，這使它們可作為治療靶點(diǎn)和疾病的臨床評(píng)估指標(biāo)。

 

文章題目：Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behcet’s disease

中文題目：?jiǎn)渭?xì)胞分析揭示了C1q-high單核細(xì)胞對(duì)貝赫切特病的促炎作用

見刊時(shí)間：2022.06

期刊名稱：PNAS

影響因子：12.779

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-seq (10X Genomics)

DOI：10.1073/pnas.2204289119

 

研究?jī)?nèi)容

1、BD中外周血單個(gè)核細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序情況

研究者對(duì)4例未接受治療的BD患者和4例健康對(duì)照人(HCs)的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序(圖1A)。共檢測(cè)出36190個(gè)高質(zhì)量的細(xì)胞，并從5個(gè)主要細(xì)胞系中的得到了20個(gè)細(xì)胞群(圖1B)，包括髓系細(xì)胞(CD33+)、T細(xì)胞(CD3D+)、自然殺傷細(xì)胞(NK) (KLRF1+)、B細(xì)胞(CD79A+)和非免疫細(xì)胞系(PPBP+)(圖1C，1D)。研究者進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞亞群分析：確定了四種髓系細(xì)胞亞型 (圖1E)，包括CD14+單核細(xì)胞(LYZ+CD14+)，CD16+單核細(xì)胞(LYZ+FCGR3A+)，常規(guī)樹突狀細(xì)胞(cDCs;CD1C+CLEC10A+)，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs;LILRA4 + CLEC4C +)；8種T細(xì)胞亞型，即新生的CD4 T細(xì)胞(CD4 T naive;CD3D+ CCR7+)，記憶CD4 T細(xì)胞(CD4 Tmemory;CD3D+ CD40LG+)，IFN相關(guān)的CD4 T細(xì)胞(CD4 T與IFN相關(guān);CD3D+ ISG15+)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs;CD3D+ FOXP3+)，先天性的T細(xì)胞(先天性淋巴細(xì)胞;CD3D+ CD127+ KLRG1+ SLC4A10+)，記憶CD8 T細(xì)胞(CD8 Tmemory;CD8A+ GZMK+)，效應(yīng)CD8 T細(xì)胞(CD8 Teffector;CD8A+ GZMB+)、增殖T細(xì)胞(增殖T;CD3D+ MKI67+)。

圖1. BD患者和健康供體外周血單個(gè)核細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序圖譜

 

2、單核細(xì)胞參與BD的系統(tǒng)免疫畸變

研究者整合了scRNA-seq(4例BD患者和4例HCs)與Bulk RNA-seq(9例BD患者和10例HCs)的數(shù)據(jù)。從Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)中研究者鑒定出了BD中有1,514個(gè)上調(diào)和325個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因(DEGs)(圖2A)。他們將這些DEGs與scRNA-seq數(shù)據(jù)中確定的細(xì)胞類型進(jìn)行映射，并發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGs在單核細(xì)胞和DCs中相對(duì)富集(圖2B)，而下調(diào)的基因在B細(xì)胞中富集(圖2C)。研究者們還發(fā)現(xiàn)：BD患者單核細(xì)胞比例高于HCs(圖2D)，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖2E)，這表明單核細(xì)胞在BD中起著重要的作用。隨后，研究者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)研究了主要細(xì)胞系中與BD進(jìn)展相關(guān)的生物學(xué)途徑。在單核細(xì)胞中，最主要的途徑是IFN-γ反應(yīng)、外源性抗原的加工和遞呈以及中性粒細(xì)胞的激活(圖2F和G)。

圖2. BD患者PBMCs中的單核細(xì)胞異常

 

3、單核細(xì)胞異質(zhì)性的鑒定

接下來研究者對(duì)4名BD患者和4名HCs的PBMCs進(jìn)行磁珠分選單核細(xì)胞(CD14+)，并進(jìn)行了scRNA-seq。共得到39385個(gè)高質(zhì)量的單核細(xì)胞，進(jìn)一步分析得到了8個(gè)細(xì)胞群 (圖3A)。然后，研究者通過評(píng)估高表達(dá)基因和相應(yīng)的富集通路來比較單核細(xì)胞所有8個(gè)亞型的功能表型(圖3B)。8個(gè)單核細(xì)胞亞型中有5個(gè)存在CD14高表達(dá)(圖3C)。在CD14低表達(dá)的3個(gè)亞型中，CD16 high單核細(xì)胞(CD16 Monos)呈現(xiàn)非經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)記物(FCGR3A、MS4A7和CX3CR1)，單核細(xì)胞來源的DC (MoDCs)呈現(xiàn)過表達(dá)抗原遞呈途徑和DC特異性基因標(biāo)記物 (CLEC10A、FCER1A、CST3和CD74)。C1qhi單核細(xì)胞(C1Q Monos)高表達(dá)補(bǔ)體1q (C1Q基因，包括C1QA、C1QB和C1QC)和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD68)(圖3C)。接下來，研究者研究了與BD相關(guān)的單核細(xì)胞組成的差異。對(duì)比BD組和HC組的相對(duì)細(xì)胞比例，他們觀察到BD患者C1Q Monos明顯增加，MoDCs明顯減少(圖3D)。通過流式細(xì)胞術(shù)，他們觀察到該亞型的存在，并驗(yàn)證了BD患者的C1Q單核細(xì)胞數(shù)量(scRNA-seq數(shù)據(jù)中的C1Q單核細(xì)胞數(shù)量)增加(圖3E、F)。

圖3. BD中單核細(xì)胞的異質(zhì)性

 

4、向C1qhi單核細(xì)胞分化的軌跡伴隨著炎癥

為了探索單核細(xì)胞亞型之間的軌跡關(guān)系，研究者又做了細(xì)胞軌跡分析。擬時(shí)序軌跡軸從MHC-II Monos分叉為兩個(gè)末端:fate 1, C1Q Monos和fate 2, MoDCs(圖4A和B)。但這兩種分布顯著不平衡，BD單核細(xì)胞在命運(yùn)1末端聚集，而HC單核細(xì)胞在命運(yùn)2末端聚集(圖4C)。這一結(jié)果與BD中C1Q單核細(xì)胞增多和MoDCs信號(hào)減少相對(duì)應(yīng)(圖3D)。研究者又研究了兩種分化軌跡下的相關(guān)基因表達(dá)譜和通路。結(jié)果顯示：編碼炎癥細(xì)胞因子相關(guān)蛋白的基因(ISG15、TNFRSF1B和S100A11)和補(bǔ)體成分(C1q基因)沿著fate 1逐漸上調(diào)(圖4D)。相反，fate 2顯示出抗原呈遞基因的變異，包括MHC-II基因(HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ)、免疫球蛋白E受體Fc片段(FCER1A和FCER2B)和DC標(biāo)記(CLEC10A、CD1C和CD74)(圖4E)。途徑富集分析發(fā)現(xiàn)，fate 1與炎癥相關(guān)通路相關(guān)，如趨化因子信號(hào)通路、核苷酸寡聚化域(NOD)樣受體信號(hào)通路和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而fate 2與抗原呈遞相關(guān)通路相關(guān)。參與單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化(RHOC, NR4A1和MAFB)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的表達(dá)在fate 1中逐漸增加，最終形成巨噬細(xì)胞樣亞型(C1Q Monos)，但在fate 2中沒有，最終形成MoDCs亞型(圖4G)。

圖4. 單核細(xì)胞亞型的分化軌跡

 

5、C1Q單核細(xì)胞參與BD的高炎癥反應(yīng)

為了測(cè)試C1Q單核細(xì)胞是否具有促炎特性，研究者分析了單核細(xì)胞的三個(gè)關(guān)鍵炎癥調(diào)節(jié)能力，包括吞噬、抗原呈遞和細(xì)胞因子分泌。C1Q單核細(xì)胞比其他亞型具有更大的功能(圖5A)，這是由BD相關(guān)的促炎細(xì)胞因子(TNF和IL6)、FcR激活因子(LYN和HCK)、細(xì)胞骨架重塑因子(PIK3CG、WASP2和VASP)和MHC-II成分的過表達(dá)引起。接下來，研究者檢測(cè)了單核細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果表明：BD C1qhi單核細(xì)胞比CD16+單核細(xì)胞和CD16單核細(xì)胞吞噬更多右旋糖酐（圖5 B、C）。他們進(jìn)一步檢測(cè)了脂多糖(LPS)刺激的單核細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況，并觀察到BD C1qhi單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6和TNF-α水平顯著高于CD16+單核細(xì)胞或CD16－單核細(xì)胞（圖5 D-G）。

圖5. C1qhi單核細(xì)胞表現(xiàn)出促炎的特性

 

6、激活的IFN-γ信號(hào)刺激了BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增

為了了解BD中C1qhi單核細(xì)胞擴(kuò)增的潛在機(jī)制，研究者首先分析了BD和HC之間C1qhi單核細(xì)胞的DEGs，并確定了BD中254個(gè)上調(diào)基因和115個(gè)下調(diào)基因。上調(diào)的基因在IFN-γ應(yīng)答通路中顯著富集(圖6A)。接下來，研究者做了SCENIC分析，并注意到調(diào)節(jié)IFN-γ反應(yīng)途徑的轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）的顯著富集，包括STAT1和IRF1(圖6B)，這些TF的表達(dá)也在BD患者的C1qhi單核細(xì)胞中升高。STAT1磷酸化被證實(shí)在BD患者的C1qhi單核細(xì)胞中顯著增加（圖6 C）。IFN-γ處理也可顯著增加HC單核細(xì)胞中C1q基因的表達(dá)(圖6D)并且可以增加C1qhi單核細(xì)胞比例(圖6E、F)。

圖6. IFN-γ水平的增加導(dǎo)致了BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增

 

7、C1qhi單核細(xì)胞將BD患者與健康供體區(qū)分開來，并對(duì)治療有反應(yīng)

為了探索C1Q Monos的潛在臨床價(jià)值，研究者在他們自己的內(nèi)部隊(duì)列(n = 19)和三個(gè)已發(fā)表的BD患者活躍隊(duì)列(GSE17114, n = 29；GSE165254, n = 25；GSE70403, n = 58)中挖掘了C1Q Monos高表達(dá)基因的預(yù)測(cè)能力。在三個(gè)隊(duì)列中，C1Q Monos中表達(dá)最多的5個(gè)基因顯著解釋了方差，并預(yù)測(cè)了曲線下面積大于0.7的BD患者(圖7A)。因此，C1Q Monos可以在不同的隊(duì)列中區(qū)分BD患者和HC。研究者又調(diào)查了通過單核細(xì)胞亞型全基因組關(guān)聯(lián)研究確定的BD相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因在C1Q Monos中具有最高平均表達(dá)水平。此外，C1qhi單核細(xì)胞與紅細(xì)胞沉降率(衡量BD炎癥程度的臨床診斷參數(shù))呈正相關(guān)(結(jié)果在補(bǔ)充圖，此處未列出)，在疾病活動(dòng)度評(píng)分高的BD患者中所占比例更高(圖7B)�？傊�，這些結(jié)果揭示了C1qhi單核細(xì)胞與疾病的顯著相關(guān)性。

此外，研究者還探討了BD患者的C1qhi單核細(xì)胞是否對(duì)藥物治療有反應(yīng)，研究表明：免疫抑制治療顯著降低了同一患者的C1qhi單核細(xì)胞(圖7 C)。他們接下來測(cè)試了C1qhi單核細(xì)胞是否對(duì)tofacitinib有反應(yīng)，研究表明：tofacitinib治療顯著降低了IFN-γ刺激的C1qhi單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平(圖7D)和蛋白質(zhì)水平(圖7E)。以上結(jié)果為C1qhi單核細(xì)胞在監(jiān)測(cè)治療效果方面的潛力提供了見解，并表明靶向C1qhi單核細(xì)胞可能是BD治療的有效策略。

圖7. C1qhi單核細(xì)胞區(qū)分了BD患者和HCs，并對(duì)BD治療有反應(yīng)

 

主要結(jié)論

研究者對(duì)BD患者和HCs的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序和Bulk RNA測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)整合發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞變化顯著。隨后，研究者對(duì)BD患者和HC的PBMCs進(jìn)行磁珠分選單核細(xì)胞并進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)BD患者中C1qhi單核細(xì)胞明顯增多。并且發(fā)現(xiàn)C1Q單核細(xì)胞具有促炎特性，且BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增是由于IFN-γ水平的增加。在tofacitinib治療BD患者之后，C1qhi單核細(xì)胞會(huì)減少。此研究確定了C1qhi單核細(xì)胞在BD中的促炎作用，這些數(shù)據(jù)揭示了BD靶向治療和臨床評(píng)估的潛在靶點(diǎn)。

 

四.參考文獻(xiàn)

Zheng W, Wang X, Liu J, Yu X, Li L, Wang H, Yu J, Pei X, Li C, Wang Z, Zhang M, Zeng X, Zhang F, Wang C, Chen H, Chen HZ. Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behçet's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jun 28;119(26):e2204289119. doi: 10.1073/pnas.2204289119. Epub 2022 Jun 21. PMID: 35727985; PMCID: PMC9245671.