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影響電轉(zhuǎn)效率的因素及提高電轉(zhuǎn)效率的方法

瀏覽次數(shù):1924 發(fā)布日期:2023-8-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

最近,總有小伙伴們前來詢問在做完電轉(zhuǎn)實驗后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率太低了該怎么辦,于是小優(yōu)通過搜集多方資料、詢問技術(shù)專家,為大家找來了一些解決方案,下面我們就來一起看看吧~

 

一、什么是電轉(zhuǎn)?

俗話說得好,知己知彼,方能百戰(zhàn)百勝,所以首先我們需要清楚電轉(zhuǎn)的原理。電轉(zhuǎn),也稱電穿孔法,是通過脈沖電流在細胞膜上打孔,將外源分子(DNA、RNA 、mRNA等)導入真核細胞內(nèi),來改變細胞的特性,從而達到改造細胞的目的,是實現(xiàn)細胞基因功能和蛋白質(zhì)表達研究的重要工具。與其他細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相比,電轉(zhuǎn)具有操作簡便、適用多種細胞、重復性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點。

 

二、影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些呢?

影響電轉(zhuǎn)效率的因素有很多,總結(jié)下來有三方面:電轉(zhuǎn)過程、細胞狀態(tài)以及轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)。只有了解影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些,我們才能夠“對癥下藥”。

 

1.電轉(zhuǎn)過程

1)電轉(zhuǎn)的完整操作步驟包括電轉(zhuǎn)前操作,電轉(zhuǎn)執(zhí)行和電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)。在進行電轉(zhuǎn)前操作時,電轉(zhuǎn)試劑、細胞與轉(zhuǎn)染底物要進行混勻,如果混勻時過于激烈,會破壞轉(zhuǎn)染復合物的形成,從而導致轉(zhuǎn)染效率降低;

2)在進行電轉(zhuǎn)前操作時,電擊緩沖液的選擇也很重要,由于細胞對緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感,因此組分與細胞質(zhì)類似的緩沖液有利于細胞電擊后的存活;

3)電轉(zhuǎn)執(zhí)行時,需要控制電場強度和脈沖時間。適當提高電場強度或延長脈沖時間,能使底物更容易進入細胞,但細胞的死亡率也會增加。一般電場強度設置遵循低電場長時程的原則。如果選擇內(nèi)置優(yōu)化程序的電轉(zhuǎn)系統(tǒng),如Lonza的Nucleofector系統(tǒng),則可以節(jié)省摸索電場強度和脈沖時間的步驟。

4)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會影響細胞轉(zhuǎn)染效率,這是因為轉(zhuǎn)染試劑對細胞有損傷,這時培養(yǎng)基中的抗生素會進一步損傷細胞,因此我們建議使用不含抗生素的培養(yǎng)基或PBS;

5)電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)要注意,如果使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染后4-6h后必須進行換液,否則會由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引起細胞死亡,最終影響轉(zhuǎn)染效率。

 

2.細胞狀態(tài)

1)細胞污染對細胞狀態(tài)的影響很大,受到細菌、真菌或支原體污染的細胞都會導致轉(zhuǎn)染效率降低、細胞死亡率增加,尤其是支原體污染悄無聲息,因此一定要做好定期的支原體檢測,確保細胞狀態(tài);

2)細胞培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉(zhuǎn),但最好的轉(zhuǎn)化效率是在細胞的對數(shù)生長期(15代以內(nèi),傳代后2d)。當細胞處于對數(shù)生長期時,有絲分裂較旺盛,表面結(jié)構(gòu)密度比穩(wěn)定期的細胞差,電轉(zhuǎn)后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA。

 

3.轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)

1)不同的轉(zhuǎn)染底物對轉(zhuǎn)染效率都會產(chǎn)生不同的影響,例如質(zhì)粒DNA在大小、用量以及構(gòu)象這三方面都影響著電轉(zhuǎn)效率,IRES導致轉(zhuǎn)染效率低,轉(zhuǎn)染mRNA需要調(diào)整洗滌次數(shù)等等;

2)轉(zhuǎn)染試劑與底物的配比,也會影響轉(zhuǎn)染效率,因此需要根據(jù)說明書或參考文獻來進行配比優(yōu)化實驗,選用最佳配比濃度;

3)底物的內(nèi)毒素,也會影響轉(zhuǎn)染效率,內(nèi)毒素含量過高,會導致轉(zhuǎn)染過程中細胞狀態(tài)變差,從而增加細胞死亡率,降低轉(zhuǎn)染效率,因此要對內(nèi)毒素進行控制。

 

三、如何提高電轉(zhuǎn)效率?

我們都知道,電轉(zhuǎn)的操作是需要借助儀器來完成的,因此除了要考慮上面的這些因素外,更重要的是選擇一個高效的電轉(zhuǎn)儀。

 

注:圖片來自Lonza官網(wǎng)

 

提高電轉(zhuǎn)效率的方法

 

1.細胞收集時:

1)在消化貼壁細胞時,一定要注意終止胰酶反應,防止過度消化;最好使用專業(yè)的胰酶中和劑;

2)在進行細胞離心時,使用低轉(zhuǎn)速長時間離心,提升細胞的存活率;

3)選擇合適狀態(tài)的細胞,一般原代細胞可以傳1-2次后使用;盡量挑選迭代次數(shù)少的細胞,如果是凍存細胞,建議復蘇1-2h后使用;

4)選擇對數(shù)增長期的細胞;

5)做好支原體清除。

 

2.試劑添加:

1)電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可;

2)細胞在試劑中停留不超20min,混合好盡快開始實驗;

3)轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%,比如轉(zhuǎn)染體系100ul,底物最多添加10ul;

4)在消化的細胞進行配置時,一定要離心并完全去除殘留培養(yǎng)基;

5)在加入到電極杯中時,要避免產(chǎn)生氣泡,從而影響電脈沖;

6)對底物進行內(nèi)毒素控制;

7)轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制;

8)如果是mRNA轉(zhuǎn)染,可多洗滌2次。

 

3.程序設置:

1)使用電轉(zhuǎn)儀,程序已經(jīng)設定好,可以根據(jù)不同的細胞名稱,選擇對應的最優(yōu)程序; 根據(jù)實際情況,可以對程序進行微調(diào),確保轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率。

2)使用需要自行設置的儀器,一般電場強度設置遵循低電場、長時程的原則。

 

4.細胞重懸:

1)轉(zhuǎn)染結(jié)束之后,可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸;

2)使用無鈣培養(yǎng)基重懸,5-10min后轉(zhuǎn)移細胞到培養(yǎng)皿上;

3)后續(xù)的實驗一般在轉(zhuǎn)染后24h再進行;

4)電轉(zhuǎn)后的細胞,鋪板數(shù)量翻一倍。

 

5.轉(zhuǎn)染后細胞的培養(yǎng):選擇表達高峰期細胞做實驗。

發(fā)布者:上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司
聯(lián)系電話:4008-168-068
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