pCO₂在線監(jiān)測及反饋控制在細胞培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用

引言
過程分析技術(shù)（PAT） 作為一種在線的、連續(xù)的、自動化智能化的分析方式，相較于傳統(tǒng)離線分析方式，對于提高工藝水平和生產(chǎn)效率、優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量具有重要作用。

在抗體生產(chǎn)工藝中，pCO₂（二氧化碳分壓）值直接關(guān)系到抗體表達。pCO₂的監(jiān)測對于更好地理解和優(yōu)化大規(guī)模制造時的細胞培養(yǎng)過程至關(guān)重要。pCO₂過低時會影響細胞活性，降低產(chǎn)物比生成速率，從而會導(dǎo)致產(chǎn)物表達量大幅降低。而pCO₂過高時，會影響細胞增殖，降低細胞對葡萄糖的高效利用，影響整個表達工藝。

目前對于生產(chǎn)過程中pCO₂的監(jiān)測與控制主要依賴于離線檢測。而離線數(shù)據(jù)具有滯后性，往往無法反應(yīng)生物反應(yīng)器中的真實狀態(tài)，調(diào)控也會有延遲。因此本次實驗使用CO₂電極監(jiān)測培養(yǎng)過程中pCO₂值，驗證其可行性。

方法與結(jié)果

第一輪實驗：
在CHO-K1細胞Fed-batch培養(yǎng)過程中，使用CO₂電極進行pCO₂監(jiān)測（圖1）。整個培養(yǎng)過程中通過離線樣品血氣檢測與CO₂電極在線監(jiān)測結(jié)果進行比對，驗證電極監(jiān)測數(shù)據(jù)的可行性。

圖1 搭載CO₂電極的Opti-Cell mini

反應(yīng)器：Opti-Cell mini（迪必爾生物）
軟件系統(tǒng)：D2MS Pro設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（迪必爾生物）
罐體：Endura SUB一次性細胞罐體，3L（迪必爾生物）
CO₂電極：Sensor InPro5000i/12/220（梅特勒托利多）
血氣分析儀：ABL9（雷度米特）

第二輪實驗：
使用CloudReady+CO₂電極（圖2），實現(xiàn)實時監(jiān)測數(shù)據(jù)的反饋控制（圖3），實現(xiàn)將培養(yǎng)體系中的pCO₂控制在目標值附近。實驗過程將空氣和CO₂流量與pCO₂級聯(lián)，實現(xiàn)穩(wěn)定控制。

圖2 搭載CO₂電極的CloudReady

圖3 使用D2MS根據(jù)在線CO₂數(shù)據(jù)進行反饋控制

反應(yīng)器：CloudReady（迪必爾生物）
軟件系統(tǒng)：D2MS Pro設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（迪必爾生物）
罐體：玻璃罐體，500mL

表1 兩輪實驗工藝參數(shù)

CO₂電極監(jiān)測數(shù)據(jù)的驗證：
整個實驗過程中，CO₂電極在線監(jiān)測數(shù)據(jù)與離線血氣檢測數(shù)據(jù)如圖4所示

圖4 離線與在線監(jiān)測數(shù)據(jù)對比

通過數(shù)據(jù)對比可看出，CO₂電極在pCO₂監(jiān)測方面與傳統(tǒng)離線樣品血氣檢測結(jié)果基本一致，對整個實驗過程的pCO₂變化能夠進行全流程監(jiān)控，更加真實地反應(yīng)實驗過程變化，加強了對實驗過程的進一步理解。

CO₂電極監(jiān)測數(shù)據(jù)的反饋控制（自動化）：
在反饋控制過程中，通過Air和CO₂流量與CO₂電極監(jiān)測數(shù)據(jù)相級聯(lián)，實現(xiàn)氣體流量的自動化控制，最終實現(xiàn)將培養(yǎng)體系中的pCO₂維持在設(shè)定值40mmHg附近。

相較于傳統(tǒng)通過恒通Air來控制pCO₂的方式，本次培養(yǎng)過程中的pCO₂更加穩(wěn)定（圖5），實現(xiàn)pCO₂全過程檢測和自動化調(diào)控。

圖5 培養(yǎng)過程中pCO₂及air、CO₂流量變化（—pCO₂—Air—CO₂）

在培養(yǎng)過程中，Air和CO₂的流量與pCO₂級聯(lián)的方式來進行調(diào)控，細胞生長曲線與活率變化如圖6所示，在級聯(lián)調(diào)控模式下，細胞正常生長，前期活率維持良好,細胞后期可正常表達蛋白（圖7）。圖6 細胞生長曲線與活率變化

圖7 Titer累積曲線

總結(jié)
在本次實驗中，首先通過CO₂電極對整個實驗過程中的pCO₂進行了全過程監(jiān)控，并且與傳統(tǒng)離線樣品血氣檢測結(jié)果進行對比，最終兩者數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致，表明通過D2MS Pro適配CO₂電極，可以對實驗過程中的pCO₂進行數(shù)據(jù)監(jiān)控。

隨后，通過Air和CO₂與CO₂電極級聯(lián)控制，實現(xiàn)反饋控制，將培養(yǎng)過程中的pCO₂控制在設(shè)定值附近。最終實現(xiàn)pCO₂全過程可監(jiān)控，可控制，為研究人員的工藝優(yōu)化提供新的研究方向。

原文作者：應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE） 程黃鶴
 

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