pCO₂在線監(jiān)測(cè)及反饋控制在細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的應(yīng)用

引言
過(guò)程分析技術(shù)（PAT） 作為一種在線的、連續(xù)的、自動(dòng)化智能化的分析方式，相較于傳統(tǒng)離線分析方式，對(duì)于提高工藝水平和生產(chǎn)效率、優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量具有重要作用。

在抗體生產(chǎn)工藝中，pCO₂（二氧化碳分壓）值直接關(guān)系到抗體表達(dá)。pCO₂的監(jiān)測(cè)對(duì)于更好地理解和優(yōu)化大規(guī)模制造時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程至關(guān)重要。pCO₂過(guò)低時(shí)會(huì)影響細(xì)胞活性，降低產(chǎn)物比生成速率，從而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物表達(dá)量大幅降低。而pCO₂過(guò)高時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的高效利用，影響整個(gè)表達(dá)工藝。

目前對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中pCO₂的監(jiān)測(cè)與控制主要依賴于離線檢測(cè)。而離線數(shù)據(jù)具有滯后性，往往無(wú)法反應(yīng)生物反應(yīng)器中的真實(shí)狀態(tài)，調(diào)控也會(huì)有延遲。因此本次實(shí)驗(yàn)使用CO₂電極監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中pCO₂值，驗(yàn)證其可行性。

方法與結(jié)果

第一輪實(shí)驗(yàn)：
在CHO-K1細(xì)胞Fed-batch培養(yǎng)過(guò)程中，使用CO₂電極進(jìn)行pCO₂監(jiān)測(cè)（圖1）。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)離線樣品血?dú)鈾z測(cè)與CO₂電極在線監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證電極監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的可行性。

圖1 搭載CO₂電極的Opti-Cell mini

反應(yīng)器：Opti-Cell mini（迪必爾生物）
軟件系統(tǒng)：D2MS Pro設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（迪必爾生物）
罐體：Endura SUB一次性細(xì)胞罐體，3L（迪必爾生物）
CO₂電極：Sensor InPro5000i/12/220（梅特勒托利多）
血?dú)夥治鰞x：ABL9（雷度米特）

第二輪實(shí)驗(yàn)：
使用CloudReady+CO₂電極（圖2），實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的反饋控制（圖3），實(shí)現(xiàn)將培養(yǎng)體系中的pCO₂控制在目標(biāo)值附近。實(shí)驗(yàn)過(guò)程將空氣和CO₂流量與pCO₂級(jí)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定控制。

圖2 搭載CO₂電極的CloudReady

圖3 使用D2MS根據(jù)在線CO₂數(shù)據(jù)進(jìn)行反饋控制

反應(yīng)器：CloudReady（迪必爾生物）
軟件系統(tǒng)：D2MS Pro設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)（迪必爾生物）
罐體：玻璃罐體，500mL

表1 兩輪實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)

CO₂電極監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證：
整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CO₂電極在線監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)與離線血?dú)鈾z測(cè)數(shù)據(jù)如圖4所示

圖4 離線與在線監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比

通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比可看出，CO₂電極在pCO₂監(jiān)測(cè)方面與傳統(tǒng)離線樣品血?dú)鈾z測(cè)結(jié)果基本一致，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的pCO₂變化能夠進(jìn)行全流程監(jiān)控，更加真實(shí)地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程變化，加強(qiáng)了對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的進(jìn)一步理解。

CO₂電極監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的反饋控制（自動(dòng)化）：
在反饋控制過(guò)程中，通過(guò)Air和CO₂流量與CO₂電極監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)相級(jí)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)氣體流量的自動(dòng)化控制，最終實(shí)現(xiàn)將培養(yǎng)體系中的pCO₂維持在設(shè)定值40mmHg附近。

相較于傳統(tǒng)通過(guò)恒通Air來(lái)控制pCO₂的方式，本次培養(yǎng)過(guò)程中的pCO₂更加穩(wěn)定（圖5），實(shí)現(xiàn)pCO₂全過(guò)程檢測(cè)和自動(dòng)化調(diào)控。

圖5 培養(yǎng)過(guò)程中pCO₂及air、CO₂流量變化（—pCO₂—Air—CO₂）

在培養(yǎng)過(guò)程中，Air和CO₂的流量與pCO₂級(jí)聯(lián)的方式來(lái)進(jìn)行調(diào)控，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與活率變化如圖6所示，在級(jí)聯(lián)調(diào)控模式下，細(xì)胞正常生長(zhǎng)，前期活率維持良好,細(xì)胞后期可正常表達(dá)蛋白（圖7）。圖6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與活率變化

圖7 Titer累積曲線

總結(jié)
在本次實(shí)驗(yàn)中，首先通過(guò)CO₂電極對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的pCO₂進(jìn)行了全過(guò)程監(jiān)控，并且與傳統(tǒng)離線樣品血?dú)鈾z測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，最終兩者數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致，表明通過(guò)D2MS Pro適配CO₂電極，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的pCO₂進(jìn)行數(shù)據(jù)監(jiān)控。

隨后，通過(guò)Air和CO₂與CO₂電極級(jí)聯(lián)控制，實(shí)現(xiàn)反饋控制，將培養(yǎng)過(guò)程中的pCO₂控制在設(shè)定值附近。最終實(shí)現(xiàn)pCO₂全過(guò)程可監(jiān)控，可控制，為研究人員的工藝優(yōu)化提供新的研究方向。

原文作者：應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE） 程黃鶴
 

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