臺盼藍(lán)(Trypan Blue)染色法技術(shù)要點

臺盼藍(lán) (Trypan Blue) 染色法是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定染色方法之一。正常的活細(xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺盼藍(lán)，細(xì)胞不被染色；而死細(xì)胞的胞膜不完整，通透性增加，可使臺盼藍(lán)滲入將細(xì)胞染成藍(lán)色。因此，借助臺盼藍(lán)染色可以簡單、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

想當(dāng)年小編還是初入實驗室的小白時，以為臺盼藍(lán)染色的效果應(yīng)該是這樣的（左），然而現(xiàn)實卻是那樣的（右）
   

不是說好的“金標(biāo)準(zhǔn)”嗎？染成這樣哪里還能準(zhǔn)？

如果你是Nexcelom的粉絲，從往期文章中應(yīng)該了解過臺盼藍(lán)染色法的局限性，以及當(dāng)前最受認(rèn)可的AO/PI熒光染核法的原理和優(yōu)越性（參考小知識）。
 

細(xì)胞的死亡狀態(tài)

在細(xì)胞實驗中，我們一般會遇到兩種類型的細(xì)胞死亡：一種是自然狀態(tài)下的死亡，即細(xì)胞自身的老化或營養(yǎng)耗盡造成的死亡，通常會經(jīng)歷比較長的過程；另一種是誘導(dǎo)的瞬間死亡，比如藥物處理、熱水浴等，通常會在短時間內(nèi)發(fā)生作用。兩種不同狀態(tài)的細(xì)胞死亡會讓臺盼藍(lán)染色出現(xiàn)不同效果嗎？

自然死亡

為了模擬細(xì)胞在自然狀態(tài)下的死亡，研究者將Jurkat細(xì)胞放置在常溫下，并在0，6，12，24，48，72，96和168小時后取出部分細(xì)胞和0.4%臺盼藍(lán)1：1混合染色。
 

 

從圖片中我們可以看到，從0-12小時，死細(xì)胞大多被染成較深的藍(lán)色；而從24小時起，我們會觀察到一些淺藍(lán)色呈彌散狀態(tài)的物體（紅色箭頭）。對于這樣的未知物，研究者們起了一個可愛的名字 – “氣球” [1]。這些“氣球“到底是什么呢？是細(xì)胞變的還是某種雜質(zhì)？

在下面的小視頻中，臺盼藍(lán)染料被緩緩加入在室溫培養(yǎng)了168小時的Jurkat細(xì)胞。大家可以清楚地看到部分細(xì)胞被染成藍(lán)色后迅速膨脹和破裂，染色隨即變淺，細(xì)胞失去形態(tài)變成“氣球“。整個過程僅幾秒鐘。
 

有視頻為證，這些“氣球“狀物體就是死細(xì)胞的殘骸。但當(dāng)我們在顯微鏡下計數(shù)時，這些“氣球”由于顏色太淺通常不會被計在內(nèi)，因而導(dǎo)致死細(xì)胞的漏數(shù)和存活率的高估。研究者們將同樣的樣本用熒光核酸染料AO/PI或PI染色，并用Cellometer 細(xì)胞計數(shù)儀檢測了所有樣本的存活率。
 

從曲線圖中可以看出，臺盼藍(lán)染色測得的細(xì)胞存活率（藍(lán)色和紅色曲線）總是高于熒光染料AO/PI和PI測得的存活率（綠色和紫色曲線）。當(dāng)存活率高于80%時，臺盼藍(lán)和熒光染料測得結(jié)果間的差距較�。欢�當(dāng)存活率低于80%時，兩種方法測的結(jié)果間的差距會有顯著差距，最高可達(dá)30%！因此我們強(qiáng)烈建議對于存活率低于80%的細(xì)胞樣本應(yīng)該用熒光染核法（比如AO/PI）檢測細(xì)胞濃度和存活率[1]。

誘導(dǎo)的瞬間死亡

研究者們將Jurkat細(xì)胞分為兩份，一份用沸水浴處理15分鐘，一份不處理。處理過的細(xì)胞被認(rèn)為0%存活，不處理的細(xì)胞被認(rèn)為100%存活。將這兩份細(xì)胞按比例混合得到存活率為0，25，50，75和100%的細(xì)胞樣本。用0.4%臺盼藍(lán)或PI（碘化丙啶）熒光染料分別給樣本染色并用Cellometer 細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
 

上圖是預(yù)期存活率為100，50和0%的樣本的染色效果。不同于自然死亡的細(xì)胞，熱水浴誘導(dǎo)的死細(xì)胞臺盼藍(lán)染色后都變成了深藍(lán)色，形態(tài)完整，沒有出現(xiàn)“氣球“狀細(xì)胞。
 

 

此外，臺盼藍(lán)和PI染色測得的細(xì)胞存活率高度一致，也和預(yù)期存活率相當(dāng)接近。為什么沸水浴處理的細(xì)胞和自然死亡的細(xì)胞在臺盼藍(lán)染色上會有這么大的區(qū)別呢？一個可能的原因是沸水浴增加了細(xì)胞膜的通透性但膜依然保持完整，使得臺盼藍(lán)可以滲入到死細(xì)胞中卻不會向外擴(kuò)散。

根據(jù)這些圖片、視頻和數(shù)據(jù)，研究者們提出了一個假設(shè)：細(xì)胞膜通透性增加而依然完整時，臺盼藍(lán)可以滲入并留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈深藍(lán)色并具有細(xì)胞形態(tài)；當(dāng)細(xì)胞膜進(jìn)一步破損時，滲入的臺盼藍(lán)會撐開細(xì)胞膜并擴(kuò)散到周圍，形成“氣球”狀物體，細(xì)胞形態(tài)隨之消失[1]。簡言之，此時的死細(xì)胞已經(jīng)”Hold”不住臺盼藍(lán)了。

臺盼藍(lán)濃度

不同的臺盼藍(lán)濃度對細(xì)胞染色會有不同影響嗎？Nexcelom的科學(xué)家們將同一Jurkat細(xì)胞樣本與0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的臺盼藍(lán)以1：1比例混合，以下是部分濃度染色后的細(xì)胞圖片：
 

下面的直方圖統(tǒng)計了不同濃度臺盼藍(lán)檢測到的死細(xì)胞（較深著色）和“氣球”狀細(xì)胞的濃度。
 

 

高濃度的臺盼藍(lán)更容易使死細(xì)胞破裂產(chǎn)生“氣球“，而當(dāng)”氣球“顏色特別淺的時候容易被漏數(shù)。低濃度的臺盼藍(lán)不會產(chǎn)生”氣球“狀細(xì)胞，但過低的濃度可能不足以染上所有死細(xì)胞，使得檢測不夠靈敏。這兩種情況都會導(dǎo)致死細(xì)胞被低估，即存活率被高估[1]。Nexcelom公司建議所有Cellometer用戶使用0.2%的臺盼藍(lán)和細(xì)胞樣本1：1混合后（終濃度0.1%）上機(jī)檢測。

為了進(jìn)一步研究不同濃度臺盼藍(lán)對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生的影響，研究者分別用明場光學(xué)顯微鏡和相差顯微鏡對0.4%和0.1%臺盼藍(lán)染色的細(xì)胞進(jìn)行拍照。
 

臺盼藍(lán)染色時間

臺盼藍(lán)是一種具有毒性的化學(xué)染料，若染色時間過長除了死細(xì)胞也會滲入活細(xì)胞，降低細(xì)胞的存活率。Mascotti等人在2000年發(fā)表的一篇文獻(xiàn)中專門研究了臺盼藍(lán)和AO/PI對細(xì)胞的毒性[2]。作者們將HPC細(xì)胞和0.4%臺盼藍(lán)或AO/PI染料混合后放置在室溫。在此后的2小時測量時間中，前一小時每隔10分鐘取一次樣計數(shù)，后一小時每隔15分鐘取一次樣計數(shù)。
 

上圖記錄了每個時間點兩種方法測得的存活率。AO/PI（實心點）染色的細(xì)胞在2小時區(qū)間內(nèi)始終保持很高的存活率（~98%），而臺盼藍(lán)（空心點）染色的細(xì)胞存活率從96.2%降到了89.8%。由此可見AO/PI對細(xì)胞的毒性非常小，而臺盼藍(lán)對細(xì)胞的毒性在2小時內(nèi)已經(jīng)十分明顯。所以臺盼藍(lán)染色后需要盡快完成細(xì)胞計數(shù)，一般建議不要超過10分鐘。

總結(jié)

綜上所述，要想用臺盼藍(lán)染色做好細(xì)胞計數(shù)和存活率分析，必須

1）樣本中雜質(zhì)少，且存活率在80%以上；

2）死細(xì)胞的狀態(tài)恰到好處，能”Hold”住臺盼藍(lán)；

3）臺盼藍(lán)濃度適中；

4）染色時間不超過10分鐘。

如果無法同時滿足這4個條件，那么趕緊使用以AO/PI為代表的熒光核酸染料吧。

如果你還對什么時候選擇什么染料有疑惑，請大膽留言或毫不猶豫地騷擾Nexcelom小編😀

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參考文獻(xiàn)

1. Chan et al.  Morphological observation and analysis using automated image cytometry for the comparison of trypan blue and fluorescence-based viability detection method. Cytotechnology. 2015 May;67(3):461-73.

2. Mascotti et al.  HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion. 2000 Jun;40(6):693-6.