腺病毒（AAV）包裝常見問題及解答

病毒載體包裝過程是復(fù)雜的，在做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題。為了讓大家在病毒包裝這塊少走彎路，《細胞基因編輯小課堂欄目》特邀賽業(yè)生物細胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理針對病毒包裝常見的問題為大家進行經(jīng)驗總結(jié)與心得分享。有同學(xué)留言說想看腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）包裝，有求必應(yīng)的小賽這就安排上！
 

Q1：AAV有哪些特性呢？

Q2：實現(xiàn)AAV在動物體內(nèi)表達需要注意哪些關(guān)鍵點？

1. 血清型的選擇。AAV的血清型主要由AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)所決定，不同的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)識別不同的細胞表面受體，因此血清型的選擇會影響AAV的感染效率、組織親和性、和開始表達的時間。

2. 啟動子的選擇。是選擇廣譜性啟動子還是特異性啟動子。相比于血清型的組織特異性，特異性啟動子可實現(xiàn)細胞的特異性，因此對特異性要求較高的研究，可以選擇某種細胞特異性表達的啟動子。

3. 注射方式。對于可以進行局部注射的組織器官，采用局部多點注射靶器官可取得較好的特異性和表達效果。

4. 病毒量及滴度。根據(jù)不同的靶器官組織和所使用的不同AAV血清型（擴散能力不同），推薦注射的AAV量不同，傳遞到組織中的病毒顆粒數(shù)量對于感染效果影響很大。但AAV使用量并不是越多越好，過多的量可能出現(xiàn)病毒溢出，而且根據(jù)我們的經(jīng)驗，病毒量太多有時候甚至?xí)�出現(xiàn)表達降低的情況。想了解具體組織的病毒用量可以聯(lián)系我們咨詢。

5. 檢測時間。不同基因的表達高峰時間是不同的，再加上AAV需要從單鏈DNA變成雙鏈DNA，一般在2周可檢測到基因表達，如無抗體產(chǎn)生的影響，基因的表達可持續(xù)表達半年以上。

Q3：為什么很少用AAV做細胞感染？
主要是因為AAV轉(zhuǎn)染細胞的表達效率較低，且由于AAV是單鏈DNA，進入細胞后須經(jīng)歷一個由單鏈變成雙鏈的過程才能進行轉(zhuǎn)錄翻譯，而在沒有輔助病毒或輔助因子的情況下，這種單鏈DNA復(fù)制形成雙鏈DNA的過程十分緩慢，因此存在表達延遲的情況。

另外，體外細胞的生長速率較快，感染至細胞中的AAV會隨著細胞分裂不斷稀釋，進一步導(dǎo)致其表達水平降低。而在體內(nèi)研究，注射的組織細胞通常不會有那么快的增殖，且各種AAV所攜帶的外源基因表達的因子較為豐富，因此表達豐度和持續(xù)的時間更好。

Q4：如何通過AAV實現(xiàn)體內(nèi)的特異性表達？
由于目的基因在不同組織中功能不同，以及同一組織的不同細胞中功能也可能不同，所以我們實驗過程中經(jīng)常需要進行特異性表達。AAV可通過以下幾種方式實現(xiàn)體內(nèi)的特異性表達：
1. 組織特異性血清型。不同血清型的AAV具有不同的組織嗜性，因此首先要選擇對特定組織感染能力強的血清型AAV。

2.（細胞）特異性啟動子。血清型主要利用侵染特異性，而啟動子則是利用表達特異性，如某種特異性啟動子AAV2，可侵染多種組織，但僅在某特定細胞表達。

3. 局部注射。此外還可采用Cre依賴性基因開關(guān)（Cre-loxp系統(tǒng)），如用特異性啟動子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠實現(xiàn)特定組織或細胞目的基因的敲除。

Q5：AAV作為一種體內(nèi)常用的工具病毒，可實現(xiàn)什么功能？

1. 基因過表達。將目的基因的CDS區(qū)構(gòu)建到AAV載體，注射到動物體內(nèi)實現(xiàn)過表達。
2. 基因干擾表達。將針對目的基因設(shè)計的shRNA構(gòu)建到AAV載體，注射到動物體內(nèi)實現(xiàn)干擾表達。
3. 目的基因的敲除。將針對目的基因設(shè)計的gRNA和Cas9編碼序列分別構(gòu)建到AAV中，注射到動物體內(nèi)實現(xiàn)基因敲除。
4. 內(nèi)源過表達。將針對目的基因設(shè)計的gRNA和dCas9分別構(gòu)建到AAV載體，實現(xiàn)內(nèi)源過表達。

Q6：AAV感染后熒光弱？
熒光弱主要有2方面的原因，一是組織感染的效率較差，另外就是檢測的正確性。對于提高感染效率，則從病毒血清型是否合適、病毒使用量是否夠、滴度是否合適，注射方法是否合理等方面進行分析；而對于檢測，在組織樣本切片制備的過程中，應(yīng)考慮熒光蛋白的穩(wěn)定性，如GFP遇酸容易淬滅等因素，從而確保檢測的有效性。

另外，AAV病毒使用前需確認是否出現(xiàn)因儲存不當(dāng)而導(dǎo)致滴度下降的情況。

Q7：AAV感染后過表達效果弱？
1. 病毒量不夠：應(yīng)充分調(diào)研高分文獻報道，確定AAV滴度及用量，對于找不到參考文獻的，也歡迎咨詢我們。
2. 載體表達效率低：更換啟動子或增加強調(diào)控元件。
3. 細胞負反饋機制：少數(shù)基因受上下游嚴(yán)格調(diào)控，這種情況較難實現(xiàn)過表達。
4. 基因序列本身的元件：例如GC含量、隱蔽性剪接位點、轉(zhuǎn)錄終止信號和核酸二級結(jié)構(gòu)等，也可影響表達。因此，密碼子優(yōu)化廣泛用于增強AAV中目的基因表達。

Q8：AAV的表達效果能維持多久？
AAV在細胞內(nèi)主要是以環(huán)狀的dsDNA附加體（circularised dsDNA episomes）的形式存在，而不會像慢病毒LV那樣整合到宿主細胞的基因組。對于分裂不旺盛的細胞，如神經(jīng)元，AAV可持續(xù)表達1年以上甚至2年，對于分裂較旺盛的細胞，一般也可維持3~6個月或以上。

Q9：AAV的操作、使用安全性怎么樣？
迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性，實際上大部分人群都感染過AAV。野生型AAV在無輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成，且Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。