PCR原理、分類、應(yīng)用及PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題解決方法

PCR 或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是分子生物學(xué)中用于創(chuàng)建特定 DNA 片段的多個(gè)副本的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)是由USA生物化學(xué)家 Kary Mullis 于 1983 年開發(fā)的。通過PCR儀進(jìn)行PCR 使產(chǎn)生數(shù)百萬份 DNA 小片段成為可能。所以PCR儀也是分子生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室常用于見的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。

PCR的原理
PCR 技術(shù)基于 DNA 的酶促?gòu)?fù)制。 在 PCR 中，使用引物介導(dǎo)的酶擴(kuò)增一小段DNA 。DNA 聚合酶合成與模板 DNA 互補(bǔ)的新 DNA 鏈。DNA 聚合酶只能將核苷酸添加到預(yù)先存在的 3'-OH 基團(tuán)上。因此，需要一個(gè)底漆。因此，更多的核苷酸被添加到 DNA 聚合酶的 3'''末端。 

PCR實(shí)驗(yàn)主要由三部分所組成：
1.DNA 模板– 樣本中單鏈DNA。
2.DNA 聚合酶–使用 Taq 聚合酶。Taq聚合酶屬于熱穩(wěn)定酶，在較高的溫度下不會(huì)變性。
3.寡核苷酸引物s - 這些是與單鏈和反鏈的 3' 末端互補(bǔ)的短鏈單鏈 DNA。
4.脫氧核糖核苷酸三磷酸——它們?yōu)榫酆咸峁┠芰�，�?DNA 合成的基石。
5.緩沖系統(tǒng)——鎂離子和鉀離子為 DNA 變性和復(fù)性提供了良好的環(huán)境條件。它對(duì)于保真度、聚合酶活性和穩(wěn)定性也很重要。



PCR的基本類型
PCR有以下幾種類型：
1.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，在熒光檢測(cè)系統(tǒng)的幫助下實(shí)時(shí)檢測(cè) DNA 擴(kuò)增。熒光報(bào)告基因的信號(hào)強(qiáng)度與擴(kuò)增的 DNA 分子數(shù)量成正比。該實(shí)驗(yàn)中所使用的PCR儀器一般是熒光定量PCR儀。比如：朗基的A600 PCR儀。
2.嵌套 PCR
通過嵌套PCR可以提高樣本的敏感性和特異性。由于意外引物結(jié)合位點(diǎn)的擴(kuò)增，減少了產(chǎn)物的非特異性結(jié)合。
3.多重PCR  
使用多通道高通量的PCR儀可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)擴(kuò)增許多不同的 DNA 序列。也可以用于在單個(gè) PCR 實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)。比如朗基的T30系列PCR儀。
4.定量 PCR
定量PCR主要用于通過 DNA 擴(kuò)增線性來檢測(cè)、表征和量化樣品中的已知序列。

PCR基因擴(kuò)增步驟
PCR PCR基因擴(kuò)增主要經(jīng)過3個(gè)循環(huán)反應(yīng)：

變性
當(dāng)反應(yīng)混合物加熱至 94℃ 約 0.5 至 2 分鐘時(shí)發(fā)生變性。這會(huì)破壞兩條 DNA 鏈之間的氫鍵并將其轉(zhuǎn)化為單鏈 DNA。此時(shí)，單鏈作為產(chǎn)生新 DNA 鏈的模板。此階段應(yīng)提供較長(zhǎng)時(shí)間的溫度以確保DNA鏈的解離。

退火
通過PCR儀設(shè)定的程序?qū)⒎磻?yīng)溫度降至54-60℃約20-40秒。在這里，引物與模板 DNA 上的互補(bǔ)序列結(jié)合。引物是長(zhǎng)度約為 20 至 30 個(gè)堿基的 DNA 或 RNA 的單鏈序列。
引物是 DNA 合成的起點(diǎn)。DNA鏈分開后以相反的方向運(yùn)行，因此引物設(shè)計(jì)一般有兩個(gè)，即：正向引物和反向引物。

延伸
在這一步，溫度升高到72-80℃。Taq 聚合酶將堿基添加到引物的 3' 端。
這會(huì)在 5' 到 3' 方向上拉長(zhǎng) DNA。DNA聚合酶在適宜的溫度下增加約1000bp/分鐘。
Taq 聚合酶可以耐受較高的溫度。它附著在引物上并將 DNA 堿基添加到單鏈中。從而獲得了雙鏈DNA分子。

這三個(gè)步驟一般重復(fù) 20-40 次，即可在短的時(shí)間內(nèi)獲得許多目標(biāo)的 DNA 序列。

PCR技術(shù)的應(yīng)用
PCR技術(shù)主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：
l 藥物
l 遺傳病突變檢測(cè)。
l 基因檢測(cè)
l 檢測(cè)父母的致病基因。
l 法醫(yī)學(xué)
l 用作基因指紋識(shí)別的工具
l DNA鑒定
l 親子鑒定
l 研究和遺傳學(xué)
l 在基因組研究中比較兩種生物的基因組
l 用于任何來源（例如化石）的 DNA 的系統(tǒng)分析
l 基因表達(dá)分析
l 基因圖譜構(gòu)建

PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題及解決方案

PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題匯總
問題及現(xiàn)象	原因	解決方案
1. PCR 后，管中的液體較少。	樣品揮發(fā)，損失	確保加熱的蓋子達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?/td>
		吸取樣本后，盡快蓋上PCR 管的蓋子。防止揮發(fā)。
	移液不準(zhǔn)確	確保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到  PCR 管中。樣本量少時(shí)需要采用高精度移液器。
2.在 QuickStrip 中沒有足夠的樣本	QuikStrip 已變干。	加入 40 μL 水，在裝載前輕輕上下移液以混合均勻。
3.電泳凝膠上看不到條帶、對(duì)照 DNA 和PCR 產(chǎn)物	凝膠未正確制備。	確保正確稀釋電泳緩沖液。
		融化瓊脂糖時(shí)需要特別注意較高濃度 (>0.8%) 的凝膠。在倒入凝膠之前，確保溶液完全沒有“團(tuán)塊 ”和玻璃狀顆粒，也可以直接使用配置好的預(yù)制膠。省時(shí)省力。
	凝膠未正確染色。	染色時(shí)注意濃度，實(shí)在不行就重新染色。
	電泳裝置或電源出現(xiàn)故障。	請(qǐng)聯(lián)系電泳儀或電泳設(shè)備供應(yīng)商，幫忙排除故障
4.凝膠染色后，DNA 條帶模糊。	凝膠沒有染色足夠長(zhǎng)的時(shí)間。	嚴(yán)格按照染色流程說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
5.染色后，條帶可見，但不存在 PCR 產(chǎn)物。	PCR擴(kuò)增不成功。	注意引物設(shè)計(jì)是否合理，DNA聚合酶的加入量是否適宜。
		確保PCR的正確操作，溫度設(shè)計(jì)是否合理。
6.染色后，凝膠上可見條帶和對(duì)照 PCR 產(chǎn)物，其中一部分樣品不存在。	PCR 反應(yīng)中添加了錯(cuò)誤體積的 DNA 和引物。	熟練使用移液器進(jìn)行精準(zhǔn)移液定量，確保移液的準(zhǔn)確度