Ecsit-EGFP報告基因小鼠在發(fā)現(xiàn)調(diào)控CD8+ T細胞記憶形成新機制中的應用

CD8⁺記憶T細胞在機體抵御感染和癌癥中發(fā)揮著至關重要的作用，能夠建立強烈且快速的二次應答反應。目現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一系列轉(zhuǎn)錄因子可以促進CD8⁺記憶T細胞分化，包括TCF-1、BCL6、ID3和MYB等。其中以TCF-1為中心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡在CD8⁺記憶T細胞的產(chǎn)生中發(fā)揮關鍵核心作用。然而，影響TCF-1表達和活性的上游關鍵調(diào)控機制以及這些調(diào)控對CD8⁺記憶T細胞形成和功能發(fā)揮的影響仍然未知。

2024年1月，南京醫(yī)科大學楊碩教授聯(lián)合王曦和陳蕓教授以及美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院Fiachra Humphries教授合作在Nature cell biology發(fā)表題為ECSIT facilitates memory CD8⁺ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis的研究論文。該研究揭示了ECSIT蛋白可作為記憶T細胞分化關鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF-1上游重要調(diào)控蛋白，在調(diào)控CD8⁺記憶T細胞形成和促進機體持續(xù)免疫反應力中發(fā)揮重要作用。

南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院已畢業(yè)博士（現(xiàn)工作于無錫市兒童醫(yī)院檢驗科）楊勇兵和基礎醫(yī)學院博士研究生王亞男為本文的共同第一作者，南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院楊碩教授、生殖醫(yī)學與子代健康全國重點實驗室王曦教授、藥學院陳蕓教授和美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院Fiachra Humphries教授為本文的共同通訊作者。
 

圖片來源：《Nature cell biology》
（https://doi.org/10.1038/s41556-024-01351-9）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員采用Ecsit-EGFP報告基因小鼠（賽業(yè)生物提供）研究ECSIT在不同免疫細胞和不同狀態(tài)的CD8⁺ T細胞的表達

研究方法
流式細胞術、RNA-seq、ATAC-Seq、ChIP-seq/qPCR、Western blotting、免疫熒光染色、Seahorse、代謝組學。

技術路線
01 ECSIT在CD8⁺記憶T細胞中高表達
02 病原刺激下，ECSIT促進CD8⁺記憶T細胞分化和功能
03 ECSIT促進TCF-1表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控進而促進CD8^＋記憶T細胞分化和功能
04 ECSIT缺失抑制富馬酸產(chǎn)生，促進KDM5活性進而抑制Tcf7的H3K4me3修飾

研究結(jié)果
1 ECSIT在CD8⁺記憶T細胞中高表達
作者通過分析公開數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)態(tài)、感染或者黑色素瘤小鼠中，ECSIT都在CD8⁺記憶T細胞中高表達。隨后作者通過構(gòu)建Ecsit-EGFP小鼠（賽業(yè)生物提供）對此結(jié)果進行驗證，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致。
 

ECSIT在CD8⁺記憶T細胞中高表達^[1]

2 ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8⁺記憶T細胞分化
為了研究ECSIT對CD8⁺記憶T細胞形成的作用，并排除ECSIT在應答早期對CD8⁺效應T細胞的影響，作者構(gòu)建了ECSIT的Ecsit^fl/fl Rosa26^CreERT2 OT-1誘導型敲除小鼠。隨后將小鼠脾臟中的naïveCD8⁺T細胞以相同的數(shù)目分別靜脈注射到野生型受體鼠中，1天后對受體鼠注射VSV-OVA病毒感染。在感染后第21-25天對受體鼠腹腔注射他莫昔芬誘導ECSIT敲除，感染35天后檢測受體鼠OT-1記憶T細胞的變化。結(jié)果顯示CD8⁺記憶T細胞及記憶前體細胞的比例及數(shù)目在ECSIT缺失后顯著下降，并且促進記憶T細胞形成的轉(zhuǎn)錄因子的表達同樣降低。
 

ECSIT缺失抑制急性病毒感染下CD8⁺記憶T細胞分化^[1]

測序結(jié)果表明ECSIT缺失抑制CD8⁺記憶T細胞分化和Tcf7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1]

4 急性病原體刺激下，ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進KDM5酶活性，進而抑制TCF-1表達
測序發(fā)現(xiàn)ECSIT缺失顯著影響代謝相關通路，因此作者將體外誘導分化的記憶T細胞進行LC-MS代謝組學分析。結(jié)果顯示富馬酸是ECSIT缺失后下降最為明顯的代謝物。鑒于富馬酸可以抑制組蛋白去甲基化酶KDM5酶活性，以及記憶T細胞TCF-1的啟動子區(qū)域存在大量H3K4me3修飾位點，作者推測ECSIT是通過影響富馬酸產(chǎn)生來抑制KDM5酶活性，從而促進TCF-1啟動子區(qū)域H3K4me3修飾，促進TCF-1表達調(diào)控，最終影響CD8⁺記憶T細胞分化。
 

ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進KDM5酶活性，進而抑制TCF-1表達^[1]

5 ECSIT缺失促進腫瘤進展和CD8⁺ T細胞耗竭
接下來作者想探究ECSIT是否也能影響腫瘤中CD8⁺記憶T細胞的形成。因此作者對受體鼠進行B16-OVA皮下荷瘤，第二日將小鼠脾臟中的naïve CD8⁺T細胞富集出來，1：1靜脈注射到受體小鼠體內(nèi)。第10-15天對受體鼠腹腔注射他莫昔芬誘導Ecsit敲除，之后檢測腫瘤生長和小鼠存活，及腫瘤微環(huán)境中OT-1細胞的變化。結(jié)果顯示ECSIT缺失顯著促進了腫瘤生長，抑制腫瘤小鼠存活，同時腫瘤內(nèi)CD8⁺耗竭T細胞顯著增加，而干細胞樣耗竭前體細胞顯著減少。
 

ECSIT缺失促進腫瘤進展和CD8⁺ T細胞耗竭[1]

6 ECSIT缺失抑制腫瘤慢性刺激下CD8⁺干細胞樣耗竭前體細胞基因表達和TCF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控
為探究ECSIT影響腫瘤微環(huán)境中CD8⁺干細胞樣耗竭前體T細胞分化和功能的具體機制，作者將移植20天的CD45.1受體鼠中的OT-1細胞分選出來進行RNA和ATAC測序。結(jié)果顯示ECSIT缺失后，干細胞樣耗竭前體T細胞分化相關的基因表達及信號通路均顯著降低。聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，TCF-1是ECSIT影響CD8⁺干細胞樣耗竭前體T細胞分化最顯著的轉(zhuǎn)錄因子。
 

ECSIT缺失抑制CD8⁺干細胞樣耗竭前體細胞基因表達和TCF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控[1]

7 慢性刺激下，ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進KDM5酶活性，進而下調(diào)TCF-1表達
作者將體外慢性抗原刺激的OT-1細胞進行LC-MS代謝組學分析。結(jié)果表明富馬酸同樣是ECSIT缺失后下降最為明顯的代謝物。KDM5酶活性測試、H3K4me3 ChIP-seq和富馬酸二甲酯（DMF）體內(nèi)外回補實驗驗證了ECSIT通過影響富馬酸產(chǎn)生來抑制KDM5酶活性，從而促進TCF-1啟動子區(qū)域H3K4me3修飾，促進TCF-1表達調(diào)控，最終影響CD8⁺記憶T細胞分化的猜想。
 

ECSIT缺失通過抑制富馬酸產(chǎn)生來促進KDM5酶活性，進而下調(diào)TCF-1表達[1]

研究結(jié)論
綜上，該研究首次發(fā)現(xiàn)影響CD8⁺記憶T細胞分化核心轉(zhuǎn)錄因子TCF-1代謝表觀調(diào)控機制，同時發(fā)現(xiàn)進化保守蛋白ECSIT在適應性免疫CD8⁺記憶T細胞中的重要功能，揭示了富馬酸在抗腫瘤免疫聯(lián)合治療中的潛在應用價值。

原文檢索：
[1]Yang Y, Wang Y, Wang Z, Yan H, Gong Y, Hu Y, Jiang Y, Wen S, Xu F, Wang B, Humphries F, Chen Y, Wang X, Yang S. ECSIT facilitates memory CD8⁺ T cell development by mediating fumarate synthesis during viral infection and tumorigenesis. Nat Cell Biol. 2024 Feb 7. doi: 10.1038/s41556-024-01351-9.