Elispot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè))樣本制備介紹
瀏覽次數(shù):223 發(fā)布日期:2025-5-30
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Elispot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè))是一種高靈敏度的技術(shù),用以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或其它生物分子。Elispot技術(shù)作為疫苗研究免疫原性驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn),其中單核免疫細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起著決定性的作用。因此單核免疫細(xì)胞的制備流程中一些可能影響細(xì)胞活率和功能的細(xì)節(jié)需要特別注意。
一、樣本類型
目前常見的樣本類型包括人的外周血單核細(xì)胞(PBMC)、動(dòng)物脾臟提取單核細(xì)胞以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞等。Elispot實(shí)驗(yàn)對(duì)于細(xì)胞的活率要求較高,通常在90%以上的活率,能保證準(zhǔn)確的結(jié)果,有些樣本受限不能拿到高活率的,則可將細(xì)胞活率降至80%。我司對(duì)于人外周血以及小鼠脾臟組織提取單核細(xì)胞實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)如下:
表1:不同樣本類型的細(xì)胞活率比較
二、PBMC細(xì)胞提取注意事項(xiàng)
1. 人外周血離體后,放入抗凝劑的管子中,推薦使用肝素鈉,不建議使用EDTA,同時(shí)放置在室溫中,不要放置在低溫環(huán)境中,否則會(huì)影響細(xì)胞提取的活率,放置時(shí)間不要超過(guò)8小時(shí)。2. 細(xì)胞脾臟組織需要新鮮分離的脾臟,禁止凍存,同時(shí)將脾臟組織上的脂肪組織去除干凈,研磨制備單細(xì)胞懸液的過(guò)程要盡量迅速,盡量在5分鐘內(nèi)完成,離心前的所有操作。3. 所有用以提取分離單核淋巴細(xì)胞的試劑均應(yīng)提前置于室溫平衡。4. 離心機(jī)溫度設(shè)置為25℃,切勿設(shè)置低溫!5. 密度梯度離心的第一步離心,降速和升速制動(dòng)均設(shè)置為2或以下。6. 使用凍存的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),需提前復(fù)蘇細(xì)胞,然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱里至少靜置1小時(shí),再用來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。7. 細(xì)胞凍存時(shí)使用含10%DMSO/90%血清的凍存液,使用程序降溫盒逐步降溫,后置于液氮罐中保存。短期如3天內(nèi)可放置于-80℃冰箱保存。長(zhǎng)期保存則放置于液氮罐中。8. PBMC細(xì)胞制備過(guò)程中,需要將紅細(xì)胞去除干凈,若分離過(guò)程中仍有紅細(xì)胞存在可考慮使用裂紅的方法去除。
三、保存條件和時(shí)間對(duì)于PBMC的影響
表2. 不同凍存溫度下pbmc細(xì)胞活率
四、不同運(yùn)輸溫度對(duì)PBMC細(xì)胞活率以及Elispot結(jié)果的影響
1.細(xì)胞活率方面超低溫運(yùn)輸(-196℃)結(jié)果明顯優(yōu)于低溫運(yùn)輸(-80℃),但在T細(xì)胞活率方面兩者無(wú)明顯差別。
2.將不同溫度條件下寄送的PBMC樣本復(fù)蘇后,進(jìn)行Elispot實(shí)驗(yàn),都分別使用兩種不同的抗原進(jìn)行免疫刺激,然后比較不同運(yùn)輸條件下對(duì)抗原的相應(yīng)差異,結(jié)果表明超低溫運(yùn)輸條件下有更好的抗原免疫反應(yīng)。
五、細(xì)胞活率低對(duì)于Elispot的影響
1. 背景信號(hào)升高死細(xì)胞會(huì)釋放蛋白酶,核酸酶等物質(zhì),可能降解包被抗體或捕獲的細(xì)胞因子,導(dǎo)致非特異性結(jié)合或者背景斑點(diǎn)增加。
2. 有效細(xì)胞數(shù)量減少細(xì)胞活率低,功能性細(xì)胞數(shù)目不足,可能導(dǎo)致斑點(diǎn)數(shù)量減少,甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
3. 細(xì)胞功能受損CD4+T細(xì)胞尤其是DC細(xì)胞功能受限,導(dǎo)致分泌細(xì)胞因子的功能受損。
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