蛋白質(zhì)晶體的多熒光成像技術(shù)的介紹與應(yīng)用

蛋白質(zhì)結(jié)晶成像
生物晶體明確且可靠的鑒定仍然是晶體學(xué)研究的一個主要障礙，特別是在實(shí)驗初步篩選的關(guān)鍵階段。在可見范圍內(nèi)的高分辨率自動成像往往不足以識別所有產(chǎn)生或可能產(chǎn)生晶體的條件。

晶體學(xué)家經(jīng)常依靠芳香族氨基酸的固有熒光，如色氨酸，來區(qū)分鹽晶和蛋白質(zhì)晶體。紫外熒光成像檢測色氨酸的熒光，并在許多情況下產(chǎn)生高對比度的圖像，有助于表征結(jié)晶液滴。在某些情況下，蛋白質(zhì)含有很少的色氨酸氨基酸，或者根本沒有，無法使用紫外熒光成像。在蛋白質(zhì)中添加熒光分子，可以在很短的成像時間內(nèi)獲得高對比度的圖像，且樣品沒有損傷。

蛋白質(zhì)的染料標(biāo)記
有許多方法標(biāo)記蛋白質(zhì)與熒光染料，范圍從非常簡單沒有純化步驟的實(shí)驗方案，到利用利用色譜柱去除多余的染料等涉及更多步驟的方法。一種簡單的方法是將琥珀酰亞胺酯染料在DMSO中溶解，然后將其直接添加到自己的蛋白質(zhì)溶液中，等待5分鐘，然后照常分配蛋白質(zhì)。Formulatrix成像儀在檢測熒光時非常靈敏，因此只需要標(biāo)記0.1%的總蛋白即可。

在向蛋白質(zhì)中添加染料時，重要的是要使用不包含競爭性反應(yīng)性胺且pH值為7至8的緩沖液。據(jù)觀察，在等待 5分鐘后，當(dāng)標(biāo)記率低于所有賴氨酸的1%時，超過80%的染料已經(jīng)被標(biāo)記到蛋白質(zhì)上，這使得從溶液中去除多余的染料不是必要的。比率大于1％的標(biāo)記將導(dǎo)致反應(yīng)性酯的不完全水解，并導(dǎo)致溶液中過量的未結(jié)合染料在成像時產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光背景。0.1％至0.3％的標(biāo)記足以用Formulatrix成像儀生成高對比度圖像。標(biāo)記率的提高只會降低圖像質(zhì)量和/或需要純化以去除過量的染料。當(dāng)pH值非常低或非常高時，會極大影響標(biāo)記效率，導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。當(dāng)pH值約為6.5可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基末端的選擇性標(biāo)記。最佳的pH值范圍在7.0至8.4 之間，這將有助于達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。

通常來說，利用小分子修飾蛋白質(zhì)的想法是會令人不安的，會引起是否對結(jié)晶和構(gòu)象產(chǎn)生負(fù)面影響的擔(dān)憂。這里描述的方案和例子是0.1%的可用賴氨酸被標(biāo)記的蛋白質(zhì)，結(jié)果對其余99.9%的蛋白質(zhì)影響很小。話雖如此，這也不是一個完全受控的過程，可以想象標(biāo)記蛋白的構(gòu)象會受到不同染料附著位置的影響。值得注意的是，這是賴氨酸與染料結(jié)合的一個相對隨機(jī)的過程，其構(gòu)象會發(fā)生變化，但與99.9%未標(biāo)記的蛋白質(zhì)相比，仍在統(tǒng)計學(xué)上并不相關(guān)。晶體學(xué)是一種平均技術(shù)，其最終結(jié)構(gòu)是晶體中每個分子的平均。

因此，0.1%蛋白質(zhì)的異常將被平均掉，而不會影響最終的整體晶體結(jié)構(gòu)。

此外，衍射質(zhì)量的晶體是由非常均勻的蛋白質(zhì)分子組成的。這意味著，如果標(biāo)記影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/構(gòu)象，被標(biāo)記的蛋白質(zhì)將不會率先進(jìn)入晶體。反之亦然，如果標(biāo)記的蛋白質(zhì)最終處于衍射晶體中，其構(gòu)象將與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)幾乎相同，而不會對晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。這是預(yù)期的結(jié)果，也是該技術(shù)所依賴的。

多熒光成像
Formulatrix成像儀提供了對三種不同波長的結(jié)晶板進(jìn)行自動成像的功能。這使得科學(xué)家可以利用紫外通道和其他兩種可見光波段的固有熒光。光學(xué)器件設(shè)計用于紫外和可見熒光成像，每個通道都有單獨(dú)的光源，以提高靈敏度。當(dāng)對結(jié)晶板成像時，濾鏡立方體會自動切換，并且可以完全自定義使用目標(biāo)染料（圖1）。

圖1. 具有3個完全可定制的濾光器模塊自動切換的多 熒光光學(xué)路徑。

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物檢測通過多熒光成像得以簡化。一個人操作就可以簡單地用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記每個蛋白質(zhì)，圖像上都有可見的熒光通道，只要發(fā)現(xiàn)熒光重疊，就可以知道這兩種蛋白質(zhì)都存在于晶體中（圖2）。

圖2. 蛋白A-蛋白B復(fù)合物晶體，其中蛋白A標(biāo)記為texas red，蛋白B標(biāo)記為熒光素。

熒光染料的選擇和影響
可以根據(jù)所使用的蛋白質(zhì)、pH值范圍和成本來選擇染料。同樣重要的是，確保如果使用兩個不同的染料有最小光譜重疊。通常來說，所有的N-羥基琥珀酰亞胺酯綴合染料在水溶性條件下都是有效的標(biāo)記。熒光素和texas red是兩種便宜的染料，在光譜上是分離的，并能產(chǎn)生良好的結(jié)果。然而，它們確實(shí)表現(xiàn)出了對pH依賴性，熒光素對pH小于7.0特別敏感，pKa為6.4（圖3），因此在各種蛋白酶抑制劑Cocktail的條件下篩選并不理想。Alexa 488和Alexa 594是兩種光譜分離染料的好選擇，在各種條件下都能很好地工作， 并且在pH4和10之間沒有pH依賴性。

圖3.熒光素的pH依賴性光譜：A）吸收光譜，B）發(fā)射光譜。

膜蛋白的標(biāo)記
膜蛋白的標(biāo)記不像可溶性蛋白那么容易。對于膜蛋白來說，可能無法獲得大量的賴氨酸殘基，這使得難以確定要添加的正確染料量。而且，大多數(shù)熒光染料包含高度疏水的芳族環(huán)，該芳族環(huán)通過與帶電基團(tuán)連接而變得水溶性。因此，許多染料會分解成疏水性去污劑微團(tuán)或微細(xì)胞，導(dǎo)致溶液中的有效濃度發(fā)生變化，未反應(yīng)染料的濃度變高。Cherezov在他的FRAP 分析方法論文中解釋了一個標(biāo)記膜蛋白的有用例子。

用可見熒光屏蔽
使用熒光染料提高了靈敏度，因此在篩選時更容易找到晶體。例如，與周圍的沉淀物相比，由于小晶體中蛋白質(zhì)的濃度較高，因此可以區(qū)分掩埋在沉淀物下的小晶體（圖4）。使用高倍物鏡也可以看到高分辨率小晶體。大范圍的變焦值允許液滴自動定位，然后以更高的穩(wěn)定性成像。還可以以更高的分辨率查詢自定義的感興趣區(qū)域，以產(chǎn)生更精細(xì)的細(xì)節(jié)和對比度（圖5）。

圖4.小的蛋白質(zhì)晶體在可見的熒光圖像中可視化，否則在傳統(tǒng)的明場圖像中將看不到。

圖5. Formulatrix成像儀中的大視野范圍使液滴可以自動成像，
并且可以定義感興趣的自定義區(qū)域以產(chǎn)生更高分辨率的圖像。

結(jié)論
多種成像技術(shù)可用于篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶板，包括可見光、雙折射光、紫外熒光和可見熒光成像。用小分子熒光團(tuán)標(biāo)記很小百分比的蛋白質(zhì)的能力使人們可以檢測高蛋白質(zhì)濃度的區(qū)域。染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光可以很容易地區(qū)分蛋白質(zhì)和鹽晶，也可以找到隱藏在沉淀物下的小晶體。當(dāng)處理蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物時，它也是一個很好的工具。人們可以簡單地使用不同染料標(biāo)記每個蛋白質(zhì)，然后成像，以查看它們在哪里發(fā)現(xiàn)熒光的共定位。這樣就可以確定晶體是否同時包含兩種蛋白質(zhì)，且無需進(jìn)行XRD表征。0.1％的標(biāo)記率對晶體質(zhì)量和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)輸出幾乎沒有影響，使其成為一種非侵入性方法。

0.1%標(biāo)記示例-溶菌酶

1. 在DMSO中溶解染料，形成5mM的原液

2. 用溶菌酶的MW常數(shù)為14.7kDa (147000 g/ mol)，可以將20 mg/ml溶菌酶溶液轉(zhuǎn)化為1.36 mM

3. 假設(shè)對氨基殘基的標(biāo)記效率為1:1，并利用溶菌酶有6個賴氨酸，100%標(biāo)記所有活性位點(diǎn)等于8.16 mM

4. 如果只需要標(biāo)記0.1%的位點(diǎn)，則染料的添加濃度應(yīng)為8.16μM

5. 在250μL的20mg/ml溶菌酶溶液中加入0.4μL 5mM染料，蛋白標(biāo)記率為0.1%