DNA甲基化技術(shù)助力揭示IRF1在創(chuàng)傷性顱腦損傷中的表觀調(diào)控機(jī)制
近日，空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科崔文興博士為第一作者，白浩博士和郭成鉉碩士為共同第一作者；屈延教授為論文通訊作者，葛順楠教授、劉海嘯副研究員為共同通訊作者在Science子刊《Science Translational Medicine》轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域頂刊上發(fā)表題為《Interferon regulatory factor-1-expressing astrocytes are epigenetically controlled and exacerbate TBI-associated pathology in mice》的科研成果。研究討論了干擾素調(diào)節(jié)因子1（Interferon Regulatory Factor-1，IRF1）在創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）中的作用及其調(diào)控機(jī)制。研究團(tuán)隊(duì)通過DNA甲基化/羥甲基化及多組學(xué)分析、基因敲除小鼠模型以及藥物篩選等方法，揭示了IRF1在TBI中通過表觀遺傳機(jī)制調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes）的促炎表型，并加劇TBI相關(guān)的病理變化。
標(biāo)題：Interferon regulatory factor-1-expressing astrocytes are epigenetically controlled and exacerbate TBI-associated pathology in mice（IRF1星形膠質(zhì)細(xì)胞受表觀遺傳調(diào)控并加劇小鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷相關(guān)病理變化）
發(fā)表時(shí)間：2025年5月28日
發(fā)表期刊：Science Translational Medicine（SCI TRANSL MED）
影響因子：IF14.6/Q1
技術(shù)平臺(tái)：scRNA-seq、RRBS、oxRRBS等
星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性與創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）病理生理學(xué)密切相關(guān)，尤其是在TBI患者發(fā)病和死亡主要原因之一的腦水腫進(jìn)展中。目前對(duì)于某些星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群如何促發(fā)急性腦損傷后的腦水腫知之甚少。本研究通過多組學(xué)方法鑒定出一個(gè)與TBI患者的臨床嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)的IRF1陽性（IRF1+）星形膠質(zhì)細(xì)胞簇（cluster）。在機(jī)制上，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的IRF1能夠結(jié)合促炎細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)神經(jīng)毒性并破壞內(nèi)皮緊密連接的完整性。通過使用Aldh1/1CreERT2; Irf1flox/flox小鼠模型驗(yàn)證了星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除Irf1能夠減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的病理活動(dòng)，改善血腦屏障（lood-Brain Barrier，BBB）破壞，并降低TBI后的腦水腫。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1活性增強(qiáng)通過釋放C-X-C基序趨化因子配體10（CXCL10）促進(jìn)了CD8+ T細(xì)胞招募，從而加劇BBB破壞和腦水腫。此外TET3（Tet Methylcytosine Dioxygenase 3）介導(dǎo)的DNA羥甲基化是上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1表達(dá)的關(guān)鍵表觀遺傳機(jī)制，從而激活促炎轉(zhuǎn)錄。本研究最后開發(fā)了一種IRF1拮抗因子8003-3282，其在TBI小鼠模型中有效減輕炎癥，保持BBB完整性，緩解腦水腫，并改善神經(jīng)學(xué)結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞是TBI相關(guān)病理的關(guān)鍵介質(zhì)，并表明靶向這一星形膠質(zhì)細(xì)胞簇（cluster）可能是減輕TBI炎癥、BBB損傷和腦水腫的潛在治療策略。
易小結(jié)
本研究通過揭示IRF1在TBI中的作用機(jī)制，為開發(fā)靶向TBI的精準(zhǔn)治療策略提供了新靶點(diǎn)。未來可以進(jìn)一步探索IRF1在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，并開發(fā)更多的IRF1靶向藥物。
RRBS和oxRRBS技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過這些技術(shù)，研究者精確分析IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化和DNA羥甲基化水平，揭示了TET3在調(diào)控IRF1表達(dá)中的表觀遺傳機(jī)制。這些技術(shù)的應(yīng)用為理解TBI中星形膠質(zhì)細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控提供了重要的分子基礎(chǔ)，并為開發(fā)靶向TBI的表觀遺傳治療策略提供了新思路。
技術(shù)更多應(yīng)用場(chǎng)景：
項(xiàng)目文章 | oxBS-seq揭示了宮頸癌發(fā)生過程中的表觀遺傳特征變化
項(xiàng)目文章 | oxBS揭示復(fù)發(fā)性膀胱癌的DNA甲基化和羥甲基化變化并鑒定預(yù)測(cè)PD-L1表達(dá)標(biāo)記物
研究方法
結(jié)果圖形
一、TBI患者腦水腫組織中細(xì)胞身份的鑒定
通過scRNA-seq分析，研究者鑒定出TBI患者腦水腫組織中的主要細(xì)胞類型，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞類型均表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)最為顯著。通過差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)TBI組中炎癥相關(guān)基因（如IL-1β、IL-6、CXCL10等）顯著上調(diào)。通過GO分析，進(jìn)一步揭示了這些細(xì)胞類型在TBI中的功能變化，如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。
圖1：有或無TBI患者腦水腫組織中細(xì)胞群落的鑒定
(A) 對(duì)6例TBI患者圍損傷皮層水腫組織中的42696個(gè)細(xì)胞以及4例無TBI對(duì)照個(gè)體皮層組織中的28974個(gè)細(xì)胞進(jìn)行UMAP降維分析，展示整合分析鑒定出的主要細(xì)胞類型。
(B) 熱圖顯示基于(A)中scRNA-seq數(shù)據(jù)所得各細(xì)胞類型關(guān)鍵標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
(C) 差異基因表達(dá)分析突出顯示TBI患者皮層組織中主要細(xì)胞類型內(nèi)上調(diào)（紅色）和下調(diào)（藍(lán)色）基因。
(D) 柱狀圖展示基于(C)中差異表達(dá)基因?qū)Ω髦饕X細(xì)胞類型進(jìn)行的GO通路富集分析結(jié)果。
(E) UMAP可視化展示TBI患者與對(duì)照組中的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群分布。
(F) 對(duì)TBI組與對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例聚類分析。
二、促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的鑒定
通過分析星形膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)，研究者鑒定出一個(gè)與TBI病理相關(guān)的IRF1陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群。這些IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出促炎和神經(jīng)毒性表型，與TBI的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。通過偽時(shí)間分析（Pseudotime Analysis），研究者揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)向促炎狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程。
(B) 對(duì)cluster 2星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的GO功能富集分析。
(C) 對(duì)各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群進(jìn)行神經(jīng)毒性和促炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞基因集評(píng)分。所用基因集包括：C3、IL1B、MX1、CD44、CXCL10、GBP2、CCL2、CHI3L1、PSMB8、SRGN、SERPING1、IFIT3、ISG15 和 CCL20。
(D) 重建星形膠質(zhì)細(xì)胞從cluster 3向cluster 2的分化軌跡。
(E) 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化狀態(tài)的估計(jì)，虛線框突出顯示cluster 2。
(F) 沿(E)所示分化軌跡的可變基因偽時(shí)間表達(dá)譜熱圖。顏色表示各基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。
(G) 在TBI患者圍損傷水腫組織及正常人腦組織中，對(duì)C3、CD44 和 GBP2（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中的免疫熒光染色（每組n=6）。
三、IRF1是促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子
通過SCENIC分析，研究者發(fā)現(xiàn)IRF1是調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在體外實(shí)驗(yàn)中，IRF1過表達(dá)顯著誘導(dǎo)促炎和神經(jīng)毒性相關(guān)基因表達(dá)，而IRF1敲低則抑制這些基因表達(dá)。通過免疫熒光染色，研究者在TBI患者的腦組織中發(fā)現(xiàn)了IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加，且IRF1表達(dá)與格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）和長(zhǎng)期神經(jīng)功能預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
(B) UMAP降維圖展示IRF1在各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中的表達(dá)，突出顯示cluster 2。
(C) UMAP可視化IRF1調(diào)控子（175個(gè)靶基因）活性，重點(diǎn)標(biāo)記cluster 2。
(D) 沿推斷的偽時(shí)間軌跡展示的轉(zhuǎn)錄因子（TF）表達(dá)模式；顏色對(duì)應(yīng)圖2D所示偽時(shí)間排序后細(xì)胞狀態(tài)。
(E) 熱圖顯示在體外原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)各TF后，促炎基因表達(dá)差異影響（每組n=3）。
(F) 在原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)TF后的GO通路富集分析。
(G) 原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)（Ad-Irf1 vs Ad-con）的GSEA分析展示促炎信號(hào)通路激活。
(H) 基于患者TBI與對(duì)照scRNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)IRF1＋與IRF1－星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性及促炎基因集評(píng)分。
(I) 左：代表性免疫熒光圖像顯示TBI患者圍損傷水腫組織與未損傷對(duì)照皮層組織中IRF1（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中的表達(dá)。右：TBI患者（n=20）與對(duì)照（n=6）IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例免疫熒光定量。
(J) TBI患者（n=20）中IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例與GCS評(píng)分的相關(guān)性分析。
(K) TBI患者（n=20）中IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例與GOSE預(yù)后評(píng)分評(píng)估的長(zhǎng)期神經(jīng)學(xué)結(jié)局相關(guān)性分析。
(L) Western blot顯示TBI患者圍損傷水腫組織與對(duì)照組織中IRF1表達(dá)（每組n=7）。
(M) Western blot顯示TBI及假手術(shù)小鼠在損傷后第3天的星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1表達(dá)（每組n=6）。
(N) 損傷后第3天，TBI小鼠圍損傷水腫、海馬、丘腦及杏仁核樣本中IRF1（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）表達(dá)的免疫熒光最大強(qiáng)度投影（每組n=6）。
四、IRF1在體外驅(qū)動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎和神經(jīng)毒性表型
通過ChIP實(shí)驗(yàn)研究者發(fā)現(xiàn)IRF1直接結(jié)合到多個(gè)促炎和神經(jīng)毒性基因的啟動(dòng)子區(qū)域，包括C3、Nos2、Gbp2等。在體外實(shí)驗(yàn)中，IRF1過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（ACM）顯著增加了神經(jīng)元死亡率，并降低神經(jīng)元樹突分支和長(zhǎng)度。通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)IRF1過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基能夠破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，增加炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。
(B) qPCR檢測(cè)ad-con或ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中指定基因表達(dá)。
(C-D) Western blot及定量檢測(cè)指定蛋白表達(dá)水平。
(E) ChIP-qPCR檢測(cè)ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1與指定基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
(F) qPCR檢測(cè)siIrf1或siScrmbl轉(zhuǎn)染并經(jīng)TIC（TNF/IL-1α/C1q）處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中指定基因表達(dá)。
(G) TIC刺激后，敲低Irf1或亂序siRNA處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎與神經(jīng)保護(hù)基因表達(dá)RNA-seq熱圖。
(H) RNA-seq的急性炎癥反應(yīng)Go term的GSEA基因集富集分析。
(I-J) 原代神經(jīng)元（MAP2標(biāo)記）暴露于不同濃度ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基后的TUNEL陽性細(xì)胞代表性圖像及定量。
(K-L) 原代神經(jīng)元暴露于25μg/ml ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM后的樹突分支數(shù)及總樹突長(zhǎng)度定量。
(M) 左側(cè)：bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)25μg/ml ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM或?qū)φ张囵B(yǎng)基處理后的代表性圖像，緊密連接蛋白ZO-1紅色標(biāo)記。右側(cè)：ZO-1熒光強(qiáng)度定量。
(N) Western blot檢測(cè)bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)遞增濃度ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM處理后ZO-1、occludin及VCAM-1的表達(dá)。
五、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性Irf1敲除抑制促炎表型并減輕TBI小鼠模型中的BBB損傷
研究者對(duì)過Aldh1/1CreERT2; Irf1flox/flox小鼠模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行特異性IRF1基因敲除（Irf1AKO）。在TBI后，Irf1AKO小鼠表現(xiàn)出顯著減少的促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、降低的腦水腫、減少的腦損傷體積和改善的神經(jīng)功能恢復(fù)。通過免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)Irf1AKO小鼠中CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少，而其他免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)未受影響。
(C) 假手術(shù)與TBI處理的Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞分支計(jì)數(shù)定量分析。
(D) 與(C)相同處理組的星形膠質(zhì)細(xì)胞總分支長(zhǎng)度定量分析。
(E) 以星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體為中心，隨距離增加的交點(diǎn)數(shù)變化Sholl 分析。
(F) TBI后圍損傷水腫區(qū)NOS2、IL-6 和 IL-1β 濃度ELISA 分析。
(G) TBI與假手術(shù)組腦含水量檢測(cè)。
(H-I) 代表性T2加權(quán)MRI圖像及腦損傷體積定量。
(J) TBI后腦組織H&E染色。上：全腦觀；下：圍損傷區(qū)放大圖。
(K) TBI后腦組織尼氏（Nissl）染色切片（每組 n = 6）。上：全腦觀；下：圍損傷區(qū)放大圖。
(L) 尼氏陽性細(xì)胞定量分析對(duì)(K)圖像圍損傷區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(M-N) 染色及染料外滲定量Evans Blue 滲漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估BBB通透性。
(O-P) Irf1fl/fl 與Irf1AKO的Western blot 分析圍損傷水腫區(qū)及對(duì)照區(qū)ZO-1與occludin表達(dá)。
(Q) 水迷宮（MWM）學(xué)習(xí)（傷后20天）與記憶階段（傷后21天）代表性游泳軌跡。
(R) 訓(xùn)練5天（傷后16–20天）逃逸潛伏期。
(S) 記憶階段（傷后21天）目標(biāo)象限停留時(shí)間。
六、IRF1通過CXCL10/CXCR3軸調(diào)控CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)
通過細(xì)胞間互作分析，研究發(fā)現(xiàn)IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞之間存在顯著CXCL10/CXCR3互作。在TBI小鼠模型中，IRF1敲除顯著降低CXCL10表達(dá)，減少了CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)，并減輕腦水腫。通過免疫熒光染色，研究者確認(rèn)CXCL10在TBI患者和小鼠模型中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌。
(B) TBI或假手術(shù)小鼠圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）與CD8＋ T細(xì)胞（CD8a，綠色）的免疫熒光染色。
(C) 促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞（cluster 2）與CD8＋ T細(xì)胞間的分子配體-受體互作圖。
(D) 圍損傷水腫區(qū)CCL2、CXCL10、CXCL14濃度：TBI或假手術(shù)Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠ELISA分析。
(E) scRNA-seq數(shù)據(jù)中各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的CXCL10表達(dá)，突出cluster 2。
(F) TBI患者與對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中CXCL10表達(dá)的代表性免疫熒光（左）及定量（右）。
(G) TBI或假手術(shù)小鼠圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中CXCL10表達(dá)免疫熒光染色及定量。
(H) TBI后給予αCXCL10或同型IgG處理的小鼠圍損傷水腫區(qū)CD8＋ T細(xì)胞代表性流式圖及定量。
(I) TBI后腦含水量測(cè)定。
(J) 代表性MRI圖像及腦損傷體積定量。
(K) ChIP-qPCR檢測(cè)ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1與CXCL10啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)的結(jié)合：位點(diǎn)1（-1629/-1615，TTGGaaaGTGaaaCT）；位點(diǎn)2（-1241/-1227，aaaTaaaaTaaaaCT）；位點(diǎn)3（-216/-201，TTGGaaaGTGaaaCT）。
(L) 突變型CXCL10啟動(dòng)子構(gòu)建體與pcDNA-Irf1共轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，鑒定IRF1響應(yīng)區(qū)域熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。
七、DNA去甲基化酶TET3介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中DNA的羥甲基化并促進(jìn)IRF1表達(dá)
通過scRNA-seq和scATAC-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)TET3在TBI后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，并且與IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA羥甲基化水平相關(guān)。通過RRBS和oxRRBS分析，研究者確認(rèn)了TET3在IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA羥甲基化作用，并發(fā)現(xiàn)TET3的敲低顯著抑制了IRF1表達(dá)。在TBI小鼠模型中，TET3敲低顯著減少促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和腦損傷體積。
(B) 點(diǎn)圖展示各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中促炎標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
(C) scATAC-seq峰圖展示cluster 2與cluster 3星形膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性；X軸為染色體位置，上方標(biāo)注Irf1基因位點(diǎn)。
(D) 經(jīng)TIC（TNF/IL-1α/C1q）或溶劑處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中DNA甲基化/去甲基化關(guān)鍵酶表達(dá)qPCR。
(E) 與假手術(shù)對(duì)照，TBI后第3天圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中TET3表達(dá)免疫熒光染色。
(F) TIC或溶劑處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子區(qū)5-羥甲基化（5hmC）水平RRBS+oxRRBS分析；柱高表示羥甲基化讀段數(shù)，下方標(biāo)注Irf1基因位點(diǎn)。
(G) hMeDIP-qPCR檢測(cè)TIC或溶劑處理星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子區(qū)的羥甲基化強(qiáng)度。
(H) RRBS+oxRRBS分析siTet3或siScrmbl轉(zhuǎn)染后經(jīng)TIC刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子5hmC水平。
(I) hMeDIP-qPCR檢測(cè)siTet3或siScrmbl轉(zhuǎn)染后經(jīng)TIC刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子羥甲基化強(qiáng)度。
(J) qPCR檢測(cè)TET3敲低后星形膠質(zhì)細(xì)胞在TIC或溶劑作用下Irf1 mRNA表達(dá)。
(K) Western blot分析與(J)相同處理組的IRF1蛋白表達(dá)。
(L) qPCR檢測(cè)TET3敲低后星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎基因表達(dá)。
(M) qPCR檢測(cè)在TIC或溶劑刺激下，過表達(dá)不同TET3結(jié)構(gòu)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1 mRNA表達(dá)。
(N) Western blot分析TIC刺激過表達(dá)不同TET3結(jié)構(gòu)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HA-TET3與IRF1蛋白水平。
(O) Western blot分析TBI或假手術(shù)后第3天，經(jīng)shTet3 AAV或?qū)φ誂AV轉(zhuǎn)導(dǎo)的分離星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1蛋白表達(dá)。
(P) 免疫熒光染色與定量分析TBI后第3天圍損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中C3（白色）表達(dá)。
(Q) 代表性MRI及腦損傷體積定量。
八、IRF1選擇性拮抗因子的設(shè)計(jì)與鑒定
通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，研究者從1667101個(gè)化合物中篩選出IRF1拮抗因子8003-3282，并通過表面等離子體共振（SPR）分析確認(rèn)其與IRF1的高親和力。在體外實(shí)驗(yàn)中，8003-3282顯著抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，并減輕了神經(jīng)毒性。在TBI小鼠模型中，8003-3282干預(yù)顯著減少了促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)、腦水腫和腦損傷體積，并改善了神經(jīng)功能恢復(fù)。
(B) 對(duì)結(jié)合親和力最高的三種先導(dǎo)化合物（6646-0021、8003-3282、S451-0769）進(jìn)行多濃度SPR傳感圖分析。
(C) 8003-3282與IRF1結(jié)合構(gòu)象：左側(cè)為整體視圖；右上為8003-3282與IRF1結(jié)構(gòu)結(jié)合的三維特寫；右下為8003-3282在IRF1結(jié)構(gòu)上的二維放大定位圖。
(D) 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)先經(jīng)8003-3282（10μM）處理后，再經(jīng)TIC刺激24 h，qPCR檢測(cè)促炎基因表達(dá)變化。
(E) TBI后接受8003-3282（10mg/kg）或溶媒處理的小鼠，免疫熒光染色與定量分析星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中C3表達(dá)。
(F) ELISA分析圍損傷水腫區(qū)NOS2、IL-6、IL-1β表達(dá)水平。
(G) 流式細(xì)胞術(shù)代表性圖及定量分析圍損傷水腫區(qū)CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)。
(H) 評(píng)估BBB通透性，染色及定量Evans Blue外滲實(shí)驗(yàn)。
(I) Western blot分析圍損傷水腫區(qū)ZO-1與occludin表達(dá)。
(J) 代表性T2加權(quán)MRI及腦損傷體積定量。
(K) 代表性H&E染色分析TBI后全腦（上）及圍損傷區(qū)放大圖（下）。
(L) 代表性Nissl染色切片及尼氏陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(M) TBI后8003-3282或溶媒處理的腦含水量分析。所有檢測(cè)均于TBI后第3天完成。
討論和啟示
本研究通過多組學(xué)分析和基因敲除小鼠模型，揭示了IRF1在TBI中的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明，IRF1通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，加劇了TBI后的炎癥反應(yīng)、BBB損傷和腦水腫。此外，研究還發(fā)現(xiàn)TET3介導(dǎo)的DNA羥甲基化是調(diào)控IRF1表達(dá)的重要表觀遺傳機(jī)制。通過篩選IRF1拮抗因子，本研究為TBI的治療提供了新策略。
參考文獻(xiàn)：
Cui W, Bai H, Guo C, Zhou J, Feng D, Zhang S, Gao F, Han L, Tian Y, Dong J, Wei F, Bai J, Wu X, Shi Y, Guo H, Wang L, Li Z, Guo W, Zhao T, Heng L, Cai Q, Liu H, Ge S, Qu Y. Interferon regulatory factor-1-expressing astrocytes are epigenetically controlled and exacerbate TBI-associated pathology in mice. Sci Transl Med. 2025 May 28;17(800):eadr5300. doi: 10.1126/scitranslmed.adr5300.
標(biāo)題：Interferon regulatory factor-1-expressing astrocytes are epigenetically controlled and exacerbate TBI-associated pathology in mice（IRF1星形膠質(zhì)細(xì)胞受表觀遺傳調(diào)控并加劇小鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷相關(guān)病理變化）
發(fā)表期刊：Science Translational Medicine（SCI TRANSL MED）
影響因子：IF14.6/Q1
技術(shù)平臺(tái)：scRNA-seq、RRBS、oxRRBS等
星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性與創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）病理生理學(xué)密切相關(guān)，尤其是在TBI患者發(fā)病和死亡主要原因之一的腦水腫進(jìn)展中。目前對(duì)于某些星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群如何促發(fā)急性腦損傷后的腦水腫知之甚少。本研究通過多組學(xué)方法鑒定出一個(gè)與TBI患者的臨床嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)的IRF1陽性（IRF1+）星形膠質(zhì)細(xì)胞簇（cluster）。在機(jī)制上，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的IRF1能夠結(jié)合促炎細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)神經(jīng)毒性并破壞內(nèi)皮緊密連接的完整性。通過使用Aldh1/1CreERT2; Irf1flox/flox小鼠模型驗(yàn)證了星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除Irf1能夠減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的病理活動(dòng)，改善血腦屏障（lood-Brain Barrier，BBB）破壞，并降低TBI后的腦水腫。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1活性增強(qiáng)通過釋放C-X-C基序趨化因子配體10（CXCL10）促進(jìn)了CD8+ T細(xì)胞招募，從而加劇BBB破壞和腦水腫。此外TET3（Tet Methylcytosine Dioxygenase 3）介導(dǎo)的DNA羥甲基化是上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1表達(dá)的關(guān)鍵表觀遺傳機(jī)制，從而激活促炎轉(zhuǎn)錄。本研究最后開發(fā)了一種IRF1拮抗因子8003-3282，其在TBI小鼠模型中有效減輕炎癥，保持BBB完整性，緩解腦水腫，并改善神經(jīng)學(xué)結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞是TBI相關(guān)病理的關(guān)鍵介質(zhì)，并表明靶向這一星形膠質(zhì)細(xì)胞簇（cluster）可能是減輕TBI炎癥、BBB損傷和腦水腫的潛在治療策略。
易小結(jié)
本研究通過揭示IRF1在TBI中的作用機(jī)制，為開發(fā)靶向TBI的精準(zhǔn)治療策略提供了新靶點(diǎn)。未來可以進(jìn)一步探索IRF1在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，并開發(fā)更多的IRF1靶向藥物。
RRBS和oxRRBS技術(shù)在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。通過這些技術(shù)，研究者精確分析IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化和DNA羥甲基化水平，揭示了TET3在調(diào)控IRF1表達(dá)中的表觀遺傳機(jī)制。這些技術(shù)的應(yīng)用為理解TBI中星形膠質(zhì)細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控提供了重要的分子基礎(chǔ)，并為開發(fā)靶向TBI的表觀遺傳治療策略提供了新思路。
技術(shù)更多應(yīng)用場(chǎng)景：
項(xiàng)目文章 | oxBS-seq揭示了宮頸癌發(fā)生過程中的表觀遺傳特征變化
項(xiàng)目文章 | oxBS揭示復(fù)發(fā)性膀胱癌的DNA甲基化和羥甲基化變化并鑒定預(yù)測(cè)PD-L1表達(dá)標(biāo)記物
研究方法
- RNA測(cè)序（RNA-seq）：通過對(duì)38個(gè)人類腦組織樣本（22例TBI患者和16例對(duì)照）進(jìn)行scRNA-seq和bulk RNA-seq分析，研究者鑒定了與TBI病理相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群。
- 基因敲除小鼠模型：利用Aldh1/1CreERT2; Irf1flox/flox小鼠模型，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性IRF1基因敲除，以評(píng)估IRF1在TBI中的作用。
- 表觀基因組學(xué)分析：通過RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）和oxRRBS（Oxidative RRBS）技術(shù)，研究者分析了IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化和DNA羥甲基化水平，揭示了TET3在調(diào)控IRF1表達(dá)中的作用。
- 藥物篩選：通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，篩選出靶向IRF1的特異性拮抗因子8003-3282，并在體外和體內(nèi)驗(yàn)證其效果。
結(jié)果圖形
一、TBI患者腦水腫組織中細(xì)胞身份的鑒定
通過scRNA-seq分析，研究者鑒定出TBI患者腦水腫組織中的主要細(xì)胞類型，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，并發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞類型均表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)最為顯著。通過差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)TBI組中炎癥相關(guān)基因（如IL-1β、IL-6、CXCL10等）顯著上調(diào)。通過GO分析，進(jìn)一步揭示了這些細(xì)胞類型在TBI中的功能變化，如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。
圖1：有或無TBI患者腦水腫組織中細(xì)胞群落的鑒定
(B) 熱圖顯示基于(A)中scRNA-seq數(shù)據(jù)所得各細(xì)胞類型關(guān)鍵標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
(C) 差異基因表達(dá)分析突出顯示TBI患者皮層組織中主要細(xì)胞類型內(nèi)上調(diào)（紅色）和下調(diào)（藍(lán)色）基因。
(D) 柱狀圖展示基于(C)中差異表達(dá)基因?qū)Ω髦饕X細(xì)胞類型進(jìn)行的GO通路富集分析結(jié)果。
(E) UMAP可視化展示TBI患者與對(duì)照組中的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群分布。
(F) 對(duì)TBI組與對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例聚類分析。
二、促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的鑒定
通過分析星形膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)，研究者鑒定出一個(gè)與TBI病理相關(guān)的IRF1陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群。這些IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出促炎和神經(jīng)毒性表型，與TBI的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。通過偽時(shí)間分析（Pseudotime Analysis），研究者揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)向促炎狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程。
圖2：促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的鑒定
(A) 點(diǎn)圖展示TBI患者與對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中典型標(biāo)記基因的表達(dá)。(B) 對(duì)cluster 2星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的GO功能富集分析。
(C) 對(duì)各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群進(jìn)行神經(jīng)毒性和促炎性星形膠質(zhì)細(xì)胞基因集評(píng)分。所用基因集包括：C3、IL1B、MX1、CD44、CXCL10、GBP2、CCL2、CHI3L1、PSMB8、SRGN、SERPING1、IFIT3、ISG15 和 CCL20。
(D) 重建星形膠質(zhì)細(xì)胞從cluster 3向cluster 2的分化軌跡。
(E) 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化狀態(tài)的估計(jì)，虛線框突出顯示cluster 2。
(F) 沿(E)所示分化軌跡的可變基因偽時(shí)間表達(dá)譜熱圖。顏色表示各基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。
(G) 在TBI患者圍損傷水腫組織及正常人腦組織中，對(duì)C3、CD44 和 GBP2（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中的免疫熒光染色（每組n=6）。
三、IRF1是促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子
通過SCENIC分析，研究者發(fā)現(xiàn)IRF1是調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在體外實(shí)驗(yàn)中，IRF1過表達(dá)顯著誘導(dǎo)促炎和神經(jīng)毒性相關(guān)基因表達(dá)，而IRF1敲低則抑制這些基因表達(dá)。通過免疫熒光染色，研究者在TBI患者的腦組織中發(fā)現(xiàn)了IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加，且IRF1表達(dá)與格拉斯哥昏迷評(píng)分（GCS）和長(zhǎng)期神經(jīng)功能預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
圖3： scRNA-seq驗(yàn)證IRF1是TBI中促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)鍵調(diào)控因子
(A) 患者TBI圍損傷水腫組織與對(duì)照星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中調(diào)控子（regulon）活性熱圖。(B) UMAP降維圖展示IRF1在各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中的表達(dá)，突出顯示cluster 2。
(C) UMAP可視化IRF1調(diào)控子（175個(gè)靶基因）活性，重點(diǎn)標(biāo)記cluster 2。
(D) 沿推斷的偽時(shí)間軌跡展示的轉(zhuǎn)錄因子（TF）表達(dá)模式；顏色對(duì)應(yīng)圖2D所示偽時(shí)間排序后細(xì)胞狀態(tài)。
(E) 熱圖顯示在體外原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)各TF后，促炎基因表達(dá)差異影響（每組n=3）。
(F) 在原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)TF后的GO通路富集分析。
(G) 原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)（Ad-Irf1 vs Ad-con）的GSEA分析展示促炎信號(hào)通路激活。
(H) 基于患者TBI與對(duì)照scRNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)IRF1＋與IRF1－星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性及促炎基因集評(píng)分。
(I) 左：代表性免疫熒光圖像顯示TBI患者圍損傷水腫組織與未損傷對(duì)照皮層組織中IRF1（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中的表達(dá)。右：TBI患者（n=20）與對(duì)照（n=6）IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例免疫熒光定量。
(J) TBI患者（n=20）中IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例與GCS評(píng)分的相關(guān)性分析。
(K) TBI患者（n=20）中IRF1＋GFAP＋細(xì)胞比例與GOSE預(yù)后評(píng)分評(píng)估的長(zhǎng)期神經(jīng)學(xué)結(jié)局相關(guān)性分析。
(L) Western blot顯示TBI患者圍損傷水腫組織與對(duì)照組織中IRF1表達(dá)（每組n=7）。
(M) Western blot顯示TBI及假手術(shù)小鼠在損傷后第3天的星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1表達(dá)（每組n=6）。
(N) 損傷后第3天，TBI小鼠圍損傷水腫、海馬、丘腦及杏仁核樣本中IRF1（綠色）在星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）表達(dá)的免疫熒光最大強(qiáng)度投影（每組n=6）。
四、IRF1在體外驅(qū)動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎和神經(jīng)毒性表型
通過ChIP實(shí)驗(yàn)研究者發(fā)現(xiàn)IRF1直接結(jié)合到多個(gè)促炎和神經(jīng)毒性基因的啟動(dòng)子區(qū)域，包括C3、Nos2、Gbp2等。在體外實(shí)驗(yàn)中，IRF1過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（ACM）顯著增加了神經(jīng)元死亡率，并降低神經(jīng)元樹突分支和長(zhǎng)度。通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)IRF1過表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基能夠破壞腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接，增加炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。
圖4：IRF1在體外促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎和神經(jīng)毒性反應(yīng)
(A) 感染腺病毒對(duì)照組（ad-con）或IRF1過表達(dá)組（ad-Irf1）的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記，紅色）免疫熒光染色檢測(cè)。(B) qPCR檢測(cè)ad-con或ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中指定基因表達(dá)。
(C-D) Western blot及定量檢測(cè)指定蛋白表達(dá)水平。
(E) ChIP-qPCR檢測(cè)ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1與指定基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。
(F) qPCR檢測(cè)siIrf1或siScrmbl轉(zhuǎn)染并經(jīng)TIC（TNF/IL-1α/C1q）處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞中指定基因表達(dá)。
(G) TIC刺激后，敲低Irf1或亂序siRNA處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中促炎與神經(jīng)保護(hù)基因表達(dá)RNA-seq熱圖。
(H) RNA-seq的急性炎癥反應(yīng)Go term的GSEA基因集富集分析。
(I-J) 原代神經(jīng)元（MAP2標(biāo)記）暴露于不同濃度ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基后的TUNEL陽性細(xì)胞代表性圖像及定量。
(K-L) 原代神經(jīng)元暴露于25μg/ml ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM后的樹突分支數(shù)及總樹突長(zhǎng)度定量。
(M) 左側(cè)：bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)25μg/ml ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM或?qū)φ张囵B(yǎng)基處理后的代表性圖像，緊密連接蛋白ZO-1紅色標(biāo)記。右側(cè)：ZO-1熒光強(qiáng)度定量。
(N) Western blot檢測(cè)bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)遞增濃度ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞ACM處理后ZO-1、occludin及VCAM-1的表達(dá)。
五、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性Irf1敲除抑制促炎表型并減輕TBI小鼠模型中的BBB損傷
研究者對(duì)過Aldh1/1CreERT2; Irf1flox/flox小鼠模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行特異性IRF1基因敲除（Irf1AKO）。在TBI后，Irf1AKO小鼠表現(xiàn)出顯著減少的促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、降低的腦水腫、減少的腦損傷體積和改善的神經(jīng)功能恢復(fù)。通過免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)Irf1AKO小鼠中CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著減少，而其他免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)未受影響。
圖5：星形膠質(zhì)細(xì)胞條件性敲除Irf1降低促炎表型、緩解BBB破壞與腦水腫，并促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能恢復(fù)
(A-B) TBI后Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中C3（綠色）表達(dá)免疫熒光染色及定量分析。(C) 假手術(shù)與TBI處理的Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞分支計(jì)數(shù)定量分析。
(D) 與(C)相同處理組的星形膠質(zhì)細(xì)胞總分支長(zhǎng)度定量分析。
(E) 以星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體為中心，隨距離增加的交點(diǎn)數(shù)變化Sholl 分析。
(F) TBI后圍損傷水腫區(qū)NOS2、IL-6 和 IL-1β 濃度ELISA 分析。
(G) TBI與假手術(shù)組腦含水量檢測(cè)。
(H-I) 代表性T2加權(quán)MRI圖像及腦損傷體積定量。
(J) TBI后腦組織H&E染色。上：全腦觀；下：圍損傷區(qū)放大圖。
(K) TBI后腦組織尼氏（Nissl）染色切片（每組 n = 6）。上：全腦觀；下：圍損傷區(qū)放大圖。
(L) 尼氏陽性細(xì)胞定量分析對(duì)(K)圖像圍損傷區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(M-N) 染色及染料外滲定量Evans Blue 滲漏實(shí)驗(yàn)評(píng)估BBB通透性。
(O-P) Irf1fl/fl 與Irf1AKO的Western blot 分析圍損傷水腫區(qū)及對(duì)照區(qū)ZO-1與occludin表達(dá)。
(Q) 水迷宮（MWM）學(xué)習(xí)（傷后20天）與記憶階段（傷后21天）代表性游泳軌跡。
(R) 訓(xùn)練5天（傷后16–20天）逃逸潛伏期。
(S) 記憶階段（傷后21天）目標(biāo)象限停留時(shí)間。
六、IRF1通過CXCL10/CXCR3軸調(diào)控CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)
通過細(xì)胞間互作分析，研究發(fā)現(xiàn)IRF1+星形膠質(zhì)細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞之間存在顯著CXCL10/CXCR3互作。在TBI小鼠模型中，IRF1敲除顯著降低CXCL10表達(dá)，減少了CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)，并減輕腦水腫。通過免疫熒光染色，研究者確認(rèn)CXCL10在TBI患者和小鼠模型中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌。
圖6：星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的CXCL10介導(dǎo)TBI后CD8＋ T細(xì)胞浸潤(rùn)與組織損傷
(A) TBI后Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠圍損傷水腫區(qū)內(nèi)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、CD4＋ T細(xì)胞、CD8＋ T細(xì)胞及NK細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)定量分析。(B) TBI或假手術(shù)小鼠圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）與CD8＋ T細(xì)胞（CD8a，綠色）的免疫熒光染色。
(C) 促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞（cluster 2）與CD8＋ T細(xì)胞間的分子配體-受體互作圖。
(D) 圍損傷水腫區(qū)CCL2、CXCL10、CXCL14濃度：TBI或假手術(shù)Irf1fl/fl 與Irf1AKO小鼠ELISA分析。
(E) scRNA-seq數(shù)據(jù)中各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群的CXCL10表達(dá)，突出cluster 2。
(F) TBI患者與對(duì)照組星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中CXCL10表達(dá)的代表性免疫熒光（左）及定量（右）。
(G) TBI或假手術(shù)小鼠圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中CXCL10表達(dá)免疫熒光染色及定量。
(H) TBI后給予αCXCL10或同型IgG處理的小鼠圍損傷水腫區(qū)CD8＋ T細(xì)胞代表性流式圖及定量。
(I) TBI后腦含水量測(cè)定。
(J) 代表性MRI圖像及腦損傷體積定量。
(K) ChIP-qPCR檢測(cè)ad-Irf1轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1與CXCL10啟動(dòng)子區(qū)不同位點(diǎn)的結(jié)合：位點(diǎn)1（-1629/-1615，TTGGaaaGTGaaaCT）；位點(diǎn)2（-1241/-1227，aaaTaaaaTaaaaCT）；位點(diǎn)3（-216/-201，TTGGaaaGTGaaaCT）。
(L) 突變型CXCL10啟動(dòng)子構(gòu)建體與pcDNA-Irf1共轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，鑒定IRF1響應(yīng)區(qū)域熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。
七、DNA去甲基化酶TET3介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中DNA的羥甲基化并促進(jìn)IRF1表達(dá)
通過scRNA-seq和scATAC-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)TET3在TBI后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，并且與IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA羥甲基化水平相關(guān)。通過RRBS和oxRRBS分析，研究者確認(rèn)了TET3在IRF1啟動(dòng)子區(qū)域的DNA羥甲基化作用，并發(fā)現(xiàn)TET3的敲低顯著抑制了IRF1表達(dá)。在TBI小鼠模型中，TET3敲低顯著減少促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和腦損傷體積。
圖7：TET3通過調(diào)節(jié)Irf1的DNA羥甲基化，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型
(A) scRNA-seq數(shù)據(jù)的UMAP降維可視化展示假手術(shù)與TBI小鼠圍損傷皮層組織中分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞。(B) 點(diǎn)圖展示各星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中促炎標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
(C) scATAC-seq峰圖展示cluster 2與cluster 3星形膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性；X軸為染色體位置，上方標(biāo)注Irf1基因位點(diǎn)。
(D) 經(jīng)TIC（TNF/IL-1α/C1q）或溶劑處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中DNA甲基化/去甲基化關(guān)鍵酶表達(dá)qPCR。
(E) 與假手術(shù)對(duì)照，TBI后第3天圍損傷水腫區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中TET3表達(dá)免疫熒光染色。
(F) TIC或溶劑處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子區(qū)5-羥甲基化（5hmC）水平RRBS+oxRRBS分析；柱高表示羥甲基化讀段數(shù)，下方標(biāo)注Irf1基因位點(diǎn)。
(G) hMeDIP-qPCR檢測(cè)TIC或溶劑處理星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子區(qū)的羥甲基化強(qiáng)度。
(H) RRBS+oxRRBS分析siTet3或siScrmbl轉(zhuǎn)染后經(jīng)TIC刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子5hmC水平。
(I) hMeDIP-qPCR檢測(cè)siTet3或siScrmbl轉(zhuǎn)染后經(jīng)TIC刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞Irf1啟動(dòng)子羥甲基化強(qiáng)度。
(J) qPCR檢測(cè)TET3敲低后星形膠質(zhì)細(xì)胞在TIC或溶劑作用下Irf1 mRNA表達(dá)。
(K) Western blot分析與(J)相同處理組的IRF1蛋白表達(dá)。
(L) qPCR檢測(cè)TET3敲低后星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎基因表達(dá)。
(M) qPCR檢測(cè)在TIC或溶劑刺激下，過表達(dá)不同TET3結(jié)構(gòu)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞中Irf1 mRNA表達(dá)。
(N) Western blot分析TIC刺激過表達(dá)不同TET3結(jié)構(gòu)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HA-TET3與IRF1蛋白水平。
(O) Western blot分析TBI或假手術(shù)后第3天，經(jīng)shTet3 AAV或?qū)φ誂AV轉(zhuǎn)導(dǎo)的分離星形膠質(zhì)細(xì)胞中IRF1蛋白表達(dá)。
(P) 免疫熒光染色與定量分析TBI后第3天圍損傷區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）中C3（白色）表達(dá)。
(Q) 代表性MRI及腦損傷體積定量。
八、IRF1選擇性拮抗因子的設(shè)計(jì)與鑒定
通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，研究者從1667101個(gè)化合物中篩選出IRF1拮抗因子8003-3282，并通過表面等離子體共振（SPR）分析確認(rèn)其與IRF1的高親和力。在體外實(shí)驗(yàn)中，8003-3282顯著抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，并減輕了神經(jīng)毒性。在TBI小鼠模型中，8003-3282干預(yù)顯著減少了促炎星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)、腦水腫和腦損傷體積，并改善了神經(jīng)功能恢復(fù)。
圖8：高選擇性IRF1拮抗因子8003-3282的篩選及其在TBI中的治療潛力
(A) 表面等離子共振（SPR）檢測(cè)50種候選化合物（10μM）與IRF1蛋白的結(jié)合親和力。(B) 對(duì)結(jié)合親和力最高的三種先導(dǎo)化合物（6646-0021、8003-3282、S451-0769）進(jìn)行多濃度SPR傳感圖分析。
(C) 8003-3282與IRF1結(jié)合構(gòu)象：左側(cè)為整體視圖；右上為8003-3282與IRF1結(jié)構(gòu)結(jié)合的三維特寫；右下為8003-3282在IRF1結(jié)構(gòu)上的二維放大定位圖。
(D) 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)先經(jīng)8003-3282（10μM）處理后，再經(jīng)TIC刺激24 h，qPCR檢測(cè)促炎基因表達(dá)變化。
(E) TBI后接受8003-3282（10mg/kg）或溶媒處理的小鼠，免疫熒光染色與定量分析星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）中C3表達(dá)。
(F) ELISA分析圍損傷水腫區(qū)NOS2、IL-6、IL-1β表達(dá)水平。
(G) 流式細(xì)胞術(shù)代表性圖及定量分析圍損傷水腫區(qū)CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)。
(H) 評(píng)估BBB通透性，染色及定量Evans Blue外滲實(shí)驗(yàn)。
(I) Western blot分析圍損傷水腫區(qū)ZO-1與occludin表達(dá)。
(J) 代表性T2加權(quán)MRI及腦損傷體積定量。
(K) 代表性H&E染色分析TBI后全腦（上）及圍損傷區(qū)放大圖（下）。
(L) 代表性Nissl染色切片及尼氏陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(M) TBI后8003-3282或溶媒處理的腦含水量分析。所有檢測(cè)均于TBI后第3天完成。
討論和啟示
本研究通過多組學(xué)分析和基因敲除小鼠模型，揭示了IRF1在TBI中的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果表明，IRF1通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的促炎表型，加劇了TBI后的炎癥反應(yīng)、BBB損傷和腦水腫。此外，研究還發(fā)現(xiàn)TET3介導(dǎo)的DNA羥甲基化是調(diào)控IRF1表達(dá)的重要表觀遺傳機(jī)制。通過篩選IRF1拮抗因子，本研究為TBI的治療提供了新策略。
參考文獻(xiàn)：
Cui W, Bai H, Guo C, Zhou J, Feng D, Zhang S, Gao F, Han L, Tian Y, Dong J, Wei F, Bai J, Wu X, Shi Y, Guo H, Wang L, Li Z, Guo W, Zhao T, Heng L, Cai Q, Liu H, Ge S, Qu Y. Interferon regulatory factor-1-expressing astrocytes are epigenetically controlled and exacerbate TBI-associated pathology in mice. Sci Transl Med. 2025 May 28;17(800):eadr5300. doi: 10.1126/scitranslmed.adr5300.
標(biāo)簽：
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