用戶(hù)文章：結(jié)合質(zhì)譜蛋白質(zhì)測(cè)序解碼蛋白質(zhì)糖基化

2025年初，上海藥物研究所的周虎研究員和文留青研究員聯(lián)合在Analytical Chemistry期刊聯(lián)合發(fā)表了一種結(jié)合質(zhì)譜蛋白質(zhì)從頭測(cè)序技術(shù)解碼未知糖蛋白的新方法：Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy，方案設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1。Fetuin-A（UniProt Accession no.P12763）是一種含有唾液酸化N糖和O糖的常用模型糖蛋白，作者首先基于Fetuin-A，用糖苷酶切除糖鏈后采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，使用PEAKS^® AB完成蛋白質(zhì)序列的自動(dòng)組裝，建立了糖蛋白的從頭測(cè)序方法，可獲得去糖基化蛋白的一級(jí)序列。接下來(lái)，使用高度復(fù)雜的糖基化蛋白藥物依那西普來(lái)驗(yàn)證該方法的性能。隨后，作者應(yīng)用該方法鑒定了三種未知 TNFR:Fc 融合生物制劑的氨基酸序列，以探索它們與原研藥物依那西普的相似性。并且，從N糖基化位點(diǎn)、游離糖、糖蛋白亞單位、糖肽的多個(gè)層面進(jìn)行了深度糖基化表征，以精確定位 N−/ O-糖基化。該方法彌合了從頭測(cè)序和糖基化修飾分析之間的差距，提供了有關(guān)糖蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和糖基化修飾的全面信息，在基礎(chǔ)研究和生物制藥行業(yè)均具有實(shí)用價(jià)值。

方法與結(jié)果

糖蛋白從頭測(cè)序方法開(kāi)發(fā)
使用PNGase F和O-糖苷酶 EngEF 分別去除Fetuin A上的 N糖和O糖，然后通過(guò)Intact Mass驗(yàn)證糖基化切除效果。去除聚糖后，大多數(shù)酶切的序列覆蓋率顯著提高，chymotrypsin、Glu-C、pepsin和trypsin的序列覆蓋率均可達(dá)到90% 以上�？紤]到不同酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)性，后續(xù)將LysC、Elestase、chymotrypsin、Glu-C、pepsin和trypsin6種酶結(jié)合使用，結(jié)果如預(yù)期，去糖后的序列可信度進(jìn)一步提升。去除糖基后，糖肽骨架的鑒定更可靠，PEAKS^® AB可直觀展示切糖前后的序列覆蓋情況（圖2）。
獲得足夠豐富的多肽碎片離子對(duì)于揭示蛋白質(zhì)相鄰氨基酸的序列至關(guān)重要。EThcD碎裂可顯著增加MS/MS譜圖中豐富的碎片離子，有利于多肽序列和翻譯后修飾的鑒定，因此作者評(píng)估了EThcD碎裂方法與常用的階梯式HCD碎裂方法。結(jié)果表明，盡管de novo候選肽的總數(shù)少于HCD 方法，但 EThcd在肽序列長(zhǎng)度（圖 3B）和譜圖質(zhì)量（圖 3C）方面更優(yōu)，EThcD譜中較長(zhǎng)的多肽對(duì)于蛋白質(zhì)序列的組裝有利（圖3D-E）。更重要的是，考慮到測(cè)序準(zhǔn)確度，EThcD方法的平均序列準(zhǔn)確度高達(dá)98.3%的，而HCD的平均準(zhǔn)確度為95.8%且包含1個(gè)gap（圖3F）。

依那西普從頭測(cè)序
為了測(cè)試前述蛋白質(zhì)從頭測(cè)序方法的穩(wěn)健性并證明在高度糖基化生物制藥中的應(yīng)用效果，作者對(duì)已上市的治療性Fc融合蛋白原藥依那西普進(jìn)行從頭測(cè)序。作為最復(fù)雜的高度糖基化Fc 融合生物藥物之一，依那西普具有至少3個(gè)N-和13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。對(duì)依那西普切除糖基化后，通過(guò) EThcD 碎裂方法獲得MS/MS譜圖，用PEAKS^® AB完成蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序。三個(gè)重復(fù)樣本的測(cè)序結(jié)果的覆蓋度均達(dá)到98.93%，準(zhǔn)確度為99.57-100%（表 1）。同時(shí)，不切糖的常規(guī)策略無(wú)法完成序列組裝，可能是因?yàn)楦叨忍腔�化�?dǎo)致MS/MS譜過(guò)于復(fù)雜，形成的序列g(shù)ap較多，無(wú)法通過(guò)從頭測(cè)序算法和多酶酶切的方法解決（圖 5）。且未覆蓋的區(qū)域位于鉸鏈區(qū)，這在人類(lèi)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)中是不存在的，這表明使用標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索方法推斷高度糖基化蛋白的全長(zhǎng)一級(jí)序列具有挑戰(zhàn)性�？傊�，本研究方法能夠?qū)μ堑鞍走M(jìn)行從頭測(cè)序，并實(shí)現(xiàn)糖基化修飾區(qū)域的深度覆蓋。  
TNFR:Fc融合生物制劑的N-/O-糖基化分析
作者從N-糖基化位點(diǎn)鑒定、游離糖、糖蛋白亞基和糖肽多個(gè)水平對(duì)TNFR:Fc融合制劑進(jìn)行了全面的N和O糖基化剖析。首先通過(guò)18O標(biāo)記對(duì)N糖基化位點(diǎn)進(jìn)行定量（圖7A）。通過(guò)計(jì)算18O位點(diǎn)所在肽段的強(qiáng)度，在四個(gè)TNFR:Fc 融合蛋白樣品中篩選出三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（N149、N171 和 N317）（圖 7B），這三個(gè)N糖基化位點(diǎn)與依那西普中已知的N糖基化位點(diǎn)完全匹配。此外，作者通過(guò)內(nèi)切糖苷酶混合物（Endo CC、Endo S 和 Endo H）部分裂解 N糖，產(chǎn)生帶有"GlcNAc"/"GlcNAc−Fuc" 的N位點(diǎn)碎片，以確認(rèn)N-糖基化位點(diǎn)的鑒定結(jié)果（圖 7A、C）。使用酶切特異性更廣的糖苷酶混合物，對(duì)N糖鏈進(jìn)行充分切割，結(jié)果與18O標(biāo)記高度一致（圖 7D）。這些結(jié)果均可用于驗(yàn)證從頭測(cè)序結(jié)果中的Asn或Asp。
為了在整個(gè)蛋白質(zhì)水平上確定N糖的含量和結(jié)構(gòu)，作者又用2-AB標(biāo)記對(duì)酶促釋放的N糖進(jìn)行衍生化，然后通過(guò)UPLC-HILIC-FLR-MS 進(jìn)行熒光和質(zhì)譜檢測(cè)。依那西普釋放的N糖中，最豐富的峰是 F(6)G2F（雙天線，核心巖藻糖基化，具有兩個(gè)末端半乳糖），其次是 F(6)G0F（雙天線，核心巖藻糖基化，無(wú)末端半乳糖殘基），G2（雙天線，具有兩個(gè)末端半乳糖殘基），以及 F(6)G1F（雙天線，核巖藻糖基化，帶有一個(gè)末端半乳糖殘基）（圖 8A）。三種TNFR：Fc融合生物制劑的結(jié)果與依那西普相似。然后，作者去除O糖和唾液酸，在亞基水平上評(píng)估了N糖的不同糖型。依那西普/TNFR:Fc 1的TNFR片段處豐度最高的糖型為G2 和 G2F（圖 8B）。而TNFR:Fc 3的TNFR片段除了主要糖型G2和G2F外，還包含許多G1F（圖 8C）。另一方面，盡管觀察到微小程度的賴(lài)氨酸丟失修飾，但在四個(gè)樣品中，F(xiàn)c片段處最突出的糖型均為G0F和G1F。

為了降低糖肽的復(fù)雜性和可變性，提高糖肽的酶切效率，作者將唾液酸酶與N-糖苷酶或O糖苷酶結(jié)合使用，以深入了解位點(diǎn)特異性 N-/O-糖基化。結(jié)果如圖8D，即N149、N171 和 N317 糖基化位點(diǎn)主要被G2、G2F 和G0F占據(jù)。N171是導(dǎo)致TNFR:Fc 3糖型差異的位點(diǎn)，含有大量的G1F。位點(diǎn)特異性N-糖肽結(jié)果與基于亞基水平的糖型分配一致，驗(yàn)證了不同酶切水平下結(jié)果的一致性。

結(jié)合手動(dòng)校驗(yàn)糖肽譜圖，作者鑒定出了依那西普和3個(gè)TNFR:Fc 融合生物制劑上的13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（圖 8E）。與之前的報(bào)道的12個(gè)O-糖基化位點(diǎn)一致。在TNFR:Fc融合生物制劑中觀察到類(lèi)似的糖基化模式。此外，對(duì)糖基化位點(diǎn)的分析揭示了鉸鏈區(qū)的高度糖基化（圖 8F）。盡管依那西普和 TNFR:Fc 融合生物制劑在骨架上存在結(jié)構(gòu)相似，但由于不同的制造工藝和細(xì)胞來(lái)源，它們?cè)谔亲V上表現(xiàn)出差異。這些發(fā)現(xiàn)突出了潛在的物理化學(xué)意義，值得進(jìn)一步研究，并有助于依那西普及其生物仿制藥的全面表征。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00960?ref=PDF

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