實時熒光定量PCR反應(yīng)體系中熒光信號物質(zhì)使用染料法及探針法的區(qū)別
前言
實時熒光定量PCR（qPCR）是一種監(jiān)控核酸擴增的技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監(jiān)控，以此實現(xiàn)對初始模板的定量分析。根據(jù)所加入的熒光化學(xué)物質(zhì)不同可分為：染料法和探針法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來實現(xiàn)檢測，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下幾乎不發(fā)出熒光信號，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其熒光信號增強約1000倍。PCR擴增時，每形成一條雙鏈，就有相應(yīng)染料與雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。SYBR Green I的最大吸收波長約在497 nm，發(fā)射波長最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質(zhì)類似，因此在qPCR設(shè)備中都是第一通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點是染料會與任何雙鏈DNA序列結(jié)合。這意味著您還可以檢測到非特異性qPCR產(chǎn)物（如引物二聚體）發(fā)出的熒光。為了消除這種風(fēng)險，可以通過熔解曲線分析來檢查反應(yīng)特異性，或使用TaqMan方法。
在qPCR反應(yīng)體系中，加入一對引物和一個特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標記一個熒光基團，3′端標記一個淬滅基團。探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，引物和探針與模板特異性結(jié)合，當(dāng)延伸到探針結(jié)合的位置時，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針水解切割，熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號開始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會水解一個探針，釋放一份熒光基團以積累熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個顯著的優(yōu)勢：
1. TaqMan 檢測僅測量靶序列的擴增進程，因為探針具有靶標特異性。
2. 通過向預(yù)混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團的TaqMan探針，您可以在單個反應(yīng)中監(jiān)測多種qPCR產(chǎn)物的量。這種多重方法允許您在每個熱循環(huán)結(jié)束時檢測多個熒光信號。
一般qPCR設(shè)備會配有1個或多個不同的熒光通道，根據(jù)儀器熒光通道的配置，可以通過對不同靶標基因的探針標記不同的熒光基團，以實現(xiàn)多重PCR的檢測。常用的熒光基團及淬滅基團如下：
QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)
杰萊美QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進的雙PID算法和溫控技術(shù)，結(jié)合免維護光學(xué)系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。配合業(yè)界領(lǐng)先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計算方法、嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學(xué)問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統(tǒng)。
該系統(tǒng)最大可實現(xiàn)單管6重?zé)晒鈾z測，6通道96孔檢測時間不超過5秒，實現(xiàn)對珍貴樣本最大限度的利用和數(shù)據(jù)挖掘。另外，可兼容各種常見的熒光基團或染料，激發(fā)/檢測波長470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發(fā)光波長，定制濾光片組激發(fā)/檢測波長范圍可達到360-750nm，還可升級FRET通道開展蛋白質(zhì)熱遷移分析或FRET探針監(jiān)測。
實時熒光定量PCR（qPCR）是一種監(jiān)控核酸擴增的技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監(jiān)控，以此實現(xiàn)對初始模板的定量分析。根據(jù)所加入的熒光化學(xué)物質(zhì)不同可分為：染料法和探針法。
SYBR Green染料法原理
染料法利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來實現(xiàn)檢測，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下幾乎不發(fā)出熒光信號，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其熒光信號增強約1000倍。PCR擴增時，每形成一條雙鏈，就有相應(yīng)染料與雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。SYBR Green I的最大吸收波長約在497 nm，發(fā)射波長最大約在520 nm，與FAM熒光染料的光譜性質(zhì)類似，因此在qPCR設(shè)備中都是第一通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。
染料法的缺點是染料會與任何雙鏈DNA序列結(jié)合。這意味著您還可以檢測到非特異性qPCR產(chǎn)物（如引物二聚體）發(fā)出的熒光。為了消除這種風(fēng)險，可以通過熔解曲線分析來檢查反應(yīng)特異性，或使用TaqMan方法。
圖1：使用染料法和探針法原理示意圖
TaqMan探針法原理在qPCR反應(yīng)體系中，加入一對引物和一個特異性的TaqMan熒光探針，探針的5′端標記一個熒光基團，3′端標記一個淬滅基團。探針完整時，熒光基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，引物和探針與模板特異性結(jié)合，當(dāng)延伸到探針結(jié)合的位置時，Taq酶利用5'端外切酶活性將探針水解切割，熒光基團和淬滅基團分離，熒光信號開始積累。所以，每形成一條DNA雙鏈，就會水解一個探針，釋放一份熒光基團以積累熒光信號，檢測到的熒光信號強度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。
與染料法相比，TaqMan探針的使用更昂貴，但也提供了兩個顯著的優(yōu)勢：
1. TaqMan 檢測僅測量靶序列的擴增進程，因為探針具有靶標特異性。
2. 通過向預(yù)混液中添加不同的引物和具有不同熒光基團的TaqMan探針，您可以在單個反應(yīng)中監(jiān)測多種qPCR產(chǎn)物的量。這種多重方法允許您在每個熱循環(huán)結(jié)束時檢測多個熒光信號。
一般qPCR設(shè)備會配有1個或多個不同的熒光通道，根據(jù)儀器熒光通道的配置，可以通過對不同靶標基因的探針標記不同的熒光基團，以實現(xiàn)多重PCR的檢測。常用的熒光基團及淬滅基團如下：
圖2：常用的熒光基團及淬滅基團
QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)
杰萊美QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進的雙PID算法和溫控技術(shù)，結(jié)合免維護光學(xué)系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。配合業(yè)界領(lǐng)先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計算方法、嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學(xué)問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統(tǒng)。
該系統(tǒng)最大可實現(xiàn)單管6重?zé)晒鈾z測，6通道96孔檢測時間不超過5秒，實現(xiàn)對珍貴樣本最大限度的利用和數(shù)據(jù)挖掘。另外，可兼容各種常見的熒光基團或染料，激發(fā)/檢測波長470-725nm。白色LED提供更寬泛的激發(fā)光波長，定制濾光片組激發(fā)/檢測波長范圍可達到360-750nm，還可升級FRET通道開展蛋白質(zhì)熱遷移分析或FRET探針監(jiān)測。
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