中喬新舟bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)流程和技巧
bEnd.3細(xì)胞 (小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)是從來(lái)自患有內(nèi)皮瘤的小鼠腦組織中分離的內(nèi)皮細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)表達(dá)多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染而轉(zhuǎn)化。在培養(yǎng)時(shí)，bEnd.3細(xì)胞最常遇到的問(wèn)題就是細(xì)胞形態(tài)變化和難消化。bEnd.3細(xì)胞本身生長(zhǎng)較慢，在低密度時(shí)會(huì)呈現(xiàn)不規(guī)則細(xì)胞形態(tài)，高密度時(shí)則呈規(guī)則纖維狀，所以若在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，則有可能是細(xì)胞密度低，建議細(xì)胞鋪滿密度較高時(shí)傳代。
一、細(xì)胞特性與培養(yǎng)價(jià)值
作為小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，bEND.3細(xì)胞因其穩(wěn)定的屏障功能表達(dá)（如緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5）和低傳代變異率，成為血腦屏障研究的首選模型。其典型特征包括：
1）梭形或多邊形：在低密度培養(yǎng)時(shí)，bEND.3 細(xì)胞通常呈現(xiàn)梭形或稍長(zhǎng)的形態(tài)，隨著細(xì)胞增殖和鋪展，形態(tài)趨于多邊形。
2）多邊形鵝卵石樣排列：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合狀態(tài)（高密度≥80%）時(shí)，bEND.3 細(xì)胞緊密連接，形成類(lèi)似“鵝卵石”狀的單層結(jié)構(gòu)，這是內(nèi)皮細(xì)胞的典型特征。
3）細(xì)胞邊界清晰：在單層培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞之間的連接較為緊密，可形成血腦屏障相關(guān)特性。
4）細(xì)胞核居中：bEND.3 細(xì)胞的細(xì)胞核一般位于中央，形態(tài)較圓，核染色質(zhì)分布均勻。
5）貼壁生長(zhǎng)：作為內(nèi)皮細(xì)胞，bEND.3 細(xì)胞主要依賴(lài)貼壁培養(yǎng)，其形態(tài)隨培養(yǎng)密度不同而變化。
以下是不同倍數(shù)下的細(xì)胞形態(tài)圖：
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖4x
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖10x
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖20x
作為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的黃金標(biāo)準(zhǔn)，bEND.3細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)需要這些核心技巧：
二、標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)流程
1. 培養(yǎng)前準(zhǔn)備
培養(yǎng)基配置
· 基礎(chǔ)液：DMEM高糖（貨號(hào)：ZQ-100）+10%胎牛血清（貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（貨號(hào)：CSP006），或用推薦的完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZM0090），每2-3天換液（密度<80%時(shí)），預(yù)熱培養(yǎng)基至37℃可減少細(xì)胞應(yīng)激
bEnd.3細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長(zhǎng)需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期測(cè)試，可保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
· 注意：每批次血清需進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)試（推薦接種1×10⁴/cm²，72小時(shí)應(yīng)達(dá)80%匯合）
耗材處理
· 培養(yǎng)瓶預(yù)包被：0.1%明膠（37℃孵育1小時(shí)）可提升初期貼壁率30%
2. 復(fù)蘇與傳代
復(fù)蘇關(guān)鍵步驟
① 快速水�。�37℃/60秒）至冰晶殘留＜10%
② 離心（800rpm/3min）去除DMSO
③ 重懸接種密度≥5×10⁴/cm²（首次換液延至24小時(shí)后）
傳代標(biāo)準(zhǔn)化
· 消化控制：0.05%胰酶室溫消化45-60秒，鏡下見(jiàn)細(xì)胞間隙擴(kuò)大即終止
· 終止技巧：加入含血清培養(yǎng)基后靜置2分鐘再吹打（減少機(jī)械損傷）
· 傳代比例：接種密度建議1×10⁴/cm²，1:3至1:4（維持24-36小時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），傳代后6小時(shí)內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶
三、典型問(wèn)題與解決方案
1）細(xì)胞形態(tài)異常與分化
1. 復(fù)蘇后分叉或碎片多
凍存/復(fù)蘇損傷導(dǎo)致形態(tài)不規(guī)則：改用無(wú)血清凍存液減少冰晶損傷，復(fù)蘇時(shí)37℃水浴時(shí)間控制在90秒內(nèi)。
增加復(fù)蘇后培養(yǎng)基血清濃度至15%-20%，緩沖細(xì)胞損傷。
2. 傳代后形態(tài)改變
胰酶消化嚴(yán)格控制在1-2分鐘，顯微鏡下80%細(xì)胞變圓立即終止（過(guò)度消化破壞細(xì)胞連接）。
傳代后24小時(shí)內(nèi)補(bǔ)充高血清培養(yǎng)基（15% FBS）促進(jìn)貼壁修復(fù)。
2）消化與傳代困難
1. 細(xì)胞難脫落
使用含EDTA的胰酶（0.25%胰酶+0.53mM EDTA）24，消化前用PBS充分沖洗去除血清殘留。
培養(yǎng)超過(guò)30代后消化時(shí)間延長(zhǎng)：分次消化（每次≤3分鐘）。
2. 傳代后生長(zhǎng)停滯
排查血清活性（建議每批次預(yù)實(shí)驗(yàn)）或是否支原體污染
確認(rèn)CO₂濃度穩(wěn)定在5%，培養(yǎng)基pH維持在7.2-7.4。
3）出現(xiàn)黑色顆粒物
通常為代謝產(chǎn)物，需增加換液頻率（48小時(shí)/次）
4）傳代后貼壁延遲
可能的原因：血清批次差異或消化損傷
解決方案：接種后6小時(shí)內(nèi)不移動(dòng)培養(yǎng)瓶，可添加10μg/ml纖連蛋白
5）自發(fā)分化
表現(xiàn)：出現(xiàn)梭形細(xì)胞
解決方案：嚴(yán)格篩選匯合度（傳代前需達(dá)90%但不超過(guò)24小時(shí)）
6）細(xì)胞突然收縮脫落
檢查CO₂濃度（5%最佳）和培養(yǎng)基pH（7.2-7.4）
7）凍存與復(fù)蘇缺陷
1. 復(fù)蘇碎片過(guò)多
離心速度限定1000rpm（約150×g）5分鐘，高速離心加劇碎片產(chǎn)生。
凍存細(xì)胞密度建議為1×10⁶~5×10⁶/mL。
2. 存活率低
干冰運(yùn)輸后需立即37℃快速?gòu)?fù)蘇，延遲操作導(dǎo)致冰晶二次損傷。
凍存液避免含血清，改用專(zhuān)用無(wú)血清配方。
8）污染與培養(yǎng)基問(wèn)題
1. 隱污染風(fēng)險(xiǎn)
傳代時(shí)添加1%雙抗（青霉素-鏈霉素），但連續(xù)使用不超過(guò)3代，避免掩蓋污染。
2. 培養(yǎng)基失效
基礎(chǔ)配方：DMEM＋10% FBS＋1%雙抗，血清批次需預(yù)測(cè)試（不同批次生長(zhǎng)差異可達(dá)30%）。
換液頻率：48-72小時(shí)/次，避免代謝廢物堆積。
一、細(xì)胞特性與培養(yǎng)價(jià)值
作為小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，bEND.3細(xì)胞因其穩(wěn)定的屏障功能表達(dá)（如緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5）和低傳代變異率，成為血腦屏障研究的首選模型。其典型特征包括：
1）梭形或多邊形：在低密度培養(yǎng)時(shí)，bEND.3 細(xì)胞通常呈現(xiàn)梭形或稍長(zhǎng)的形態(tài)，隨著細(xì)胞增殖和鋪展，形態(tài)趨于多邊形。
2）多邊形鵝卵石樣排列：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合狀態(tài)（高密度≥80%）時(shí)，bEND.3 細(xì)胞緊密連接，形成類(lèi)似“鵝卵石”狀的單層結(jié)構(gòu)，這是內(nèi)皮細(xì)胞的典型特征。
3）細(xì)胞邊界清晰：在單層培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞之間的連接較為緊密，可形成血腦屏障相關(guān)特性。
4）細(xì)胞核居中：bEND.3 細(xì)胞的細(xì)胞核一般位于中央，形態(tài)較圓，核染色質(zhì)分布均勻。
5）貼壁生長(zhǎng)：作為內(nèi)皮細(xì)胞，bEND.3 細(xì)胞主要依賴(lài)貼壁培養(yǎng)，其形態(tài)隨培養(yǎng)密度不同而變化。
以下是不同倍數(shù)下的細(xì)胞形態(tài)圖：
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖4x
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖10x
中喬新舟細(xì)胞培養(yǎng)圖20x
作為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的黃金標(biāo)準(zhǔn)，bEND.3細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)需要這些核心技巧：
二、標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)流程
1. 培養(yǎng)前準(zhǔn)備
培養(yǎng)基配置
· 基礎(chǔ)液：DMEM高糖（貨號(hào)：ZQ-100）+10%胎牛血清（貨號(hào)：ZQ0500）+1%雙抗（貨號(hào)：CSP006），或用推薦的完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：ZM0090），每2-3天換液（密度<80%時(shí)），預(yù)熱培養(yǎng)基至37℃可減少細(xì)胞應(yīng)激
bEnd.3細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長(zhǎng)需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期測(cè)試，可保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
· 注意：每批次血清需進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)試（推薦接種1×10⁴/cm²，72小時(shí)應(yīng)達(dá)80%匯合）
耗材處理
· 培養(yǎng)瓶預(yù)包被：0.1%明膠（37℃孵育1小時(shí)）可提升初期貼壁率30%
2. 復(fù)蘇與傳代
復(fù)蘇關(guān)鍵步驟
① 快速水�。�37℃/60秒）至冰晶殘留＜10%
② 離心（800rpm/3min）去除DMSO
③ 重懸接種密度≥5×10⁴/cm²（首次換液延至24小時(shí)后）
傳代標(biāo)準(zhǔn)化
· 消化控制：0.05%胰酶室溫消化45-60秒，鏡下見(jiàn)細(xì)胞間隙擴(kuò)大即終止
· 終止技巧：加入含血清培養(yǎng)基后靜置2分鐘再吹打（減少機(jī)械損傷）
· 傳代比例：接種密度建議1×10⁴/cm²，1:3至1:4（維持24-36小時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期），傳代后6小時(shí)內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶
三、典型問(wèn)題與解決方案
1）細(xì)胞形態(tài)異常與分化
1. 復(fù)蘇后分叉或碎片多
凍存/復(fù)蘇損傷導(dǎo)致形態(tài)不規(guī)則：改用無(wú)血清凍存液減少冰晶損傷，復(fù)蘇時(shí)37℃水浴時(shí)間控制在90秒內(nèi)。
增加復(fù)蘇后培養(yǎng)基血清濃度至15%-20%，緩沖細(xì)胞損傷。
2. 傳代后形態(tài)改變
胰酶消化嚴(yán)格控制在1-2分鐘，顯微鏡下80%細(xì)胞變圓立即終止（過(guò)度消化破壞細(xì)胞連接）。
傳代后24小時(shí)內(nèi)補(bǔ)充高血清培養(yǎng)基（15% FBS）促進(jìn)貼壁修復(fù)。
2）消化與傳代困難
1. 細(xì)胞難脫落
使用含EDTA的胰酶（0.25%胰酶+0.53mM EDTA）24，消化前用PBS充分沖洗去除血清殘留。
培養(yǎng)超過(guò)30代后消化時(shí)間延長(zhǎng)：分次消化（每次≤3分鐘）。
2. 傳代后生長(zhǎng)停滯
排查血清活性（建議每批次預(yù)實(shí)驗(yàn)）或是否支原體污染
確認(rèn)CO₂濃度穩(wěn)定在5%，培養(yǎng)基pH維持在7.2-7.4。
3）出現(xiàn)黑色顆粒物
通常為代謝產(chǎn)物，需增加換液頻率（48小時(shí)/次）
4）傳代后貼壁延遲
可能的原因：血清批次差異或消化損傷
解決方案：接種后6小時(shí)內(nèi)不移動(dòng)培養(yǎng)瓶，可添加10μg/ml纖連蛋白
5）自發(fā)分化
表現(xiàn)：出現(xiàn)梭形細(xì)胞
解決方案：嚴(yán)格篩選匯合度（傳代前需達(dá)90%但不超過(guò)24小時(shí)）
6）細(xì)胞突然收縮脫落
檢查CO₂濃度（5%最佳）和培養(yǎng)基pH（7.2-7.4）
7）凍存與復(fù)蘇缺陷
1. 復(fù)蘇碎片過(guò)多
離心速度限定1000rpm（約150×g）5分鐘，高速離心加劇碎片產(chǎn)生。
凍存細(xì)胞密度建議為1×10⁶~5×10⁶/mL。
2. 存活率低
干冰運(yùn)輸后需立即37℃快速?gòu)?fù)蘇，延遲操作導(dǎo)致冰晶二次損傷。
凍存液避免含血清，改用專(zhuān)用無(wú)血清配方。
8）污染與培養(yǎng)基問(wèn)題
1. 隱污染風(fēng)險(xiǎn)
傳代時(shí)添加1%雙抗（青霉素-鏈霉素），但連續(xù)使用不超過(guò)3代，避免掩蓋污染。
2. 培養(yǎng)基失效
基礎(chǔ)配方：DMEM＋10% FBS＋1%雙抗，血清批次需預(yù)測(cè)試（不同批次生長(zhǎng)差異可達(dá)30%）。
換液頻率：48-72小時(shí)/次，避免代謝廢物堆積。
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