Caco-2細(xì)胞（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞）培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)
Caco-2細(xì)胞模型是十幾年來(lái)國(guó)外廣泛采用的一種研究藥物小腸吸收的體外模型，具有相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)性較好、應(yīng)用范圍較廣的特點(diǎn)。其來(lái)源于人的直腸癌，結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系。這些性質(zhì)可以恒定維持約20天。由于Caco-2細(xì)胞性質(zhì)類似小腸上皮細(xì)胞，因此可以在這段時(shí)間進(jìn)行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。Caco-2細(xì)胞也是研究腸道屏障、藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的經(jīng)典模型，但其培養(yǎng)過(guò)程對(duì)操作細(xì)節(jié)要求極高。一個(gè)微小的疏漏可能導(dǎo)致分化失敗、污染或?qū)嶒?yàn)結(jié)果偏差。本文梳理了Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，助您輕松避開(kāi)“雷區(qū)”。
細(xì)胞來(lái)源
Caco-2細(xì)胞是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，最初是從一位72歲男性患者的直腸原位癌組織中分離出來(lái)建立的。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，能夠分化成類似小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，表現(xiàn)出微絨毛等結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，可表現(xiàn)出具有分化的腸上皮細(xì)胞的特征。Caco-2細(xì)胞因其與小腸上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，被廣泛用于模擬體內(nèi)腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)。因其在模擬人類腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的能力，已成為研究藥物代謝和口服生物利用度的重要工具。細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白II。
中喬新舟出庫(kù)圖 4X
中喬新舟出庫(kù)圖10X
Caco-2細(xì)胞特性：
培養(yǎng)條件：RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-200）+10%胎牛血清 (中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%P/S（貨號(hào)：CSP006）或者完全培養(yǎng)基（ZM0056）
Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長(zhǎng)需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期測(cè)試，可保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
倍增時(shí)間：大約32~80小時(shí)
消化時(shí)間： 5-15 min
傳代頻率：1：2傳代3天可再次傳代
l 復(fù)蘇或傳代后細(xì)胞貼壁較慢，大量細(xì)胞會(huì)漂浮并存在一些碎片，最終會(huì)以島狀形態(tài)貼壁并擴(kuò)散生長(zhǎng)。為了避免干擾細(xì)胞貼壁，48小時(shí)內(nèi)不要換液。
l 細(xì)胞形態(tài)不均一，有一些含有液泡的巨大細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有黑色顆粒物，屬正�，F(xiàn)象。
l 該細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量較為敏感，我司建議您使用品牌優(yōu)質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)或選擇訂購(gòu)我司配套Caco-2完全培養(yǎng)液。
一、 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
1、快速解凍，減少應(yīng)激
Caco-2細(xì)胞對(duì)溫度敏感，需嚴(yán)格遵循“37℃水浴快速解凍→逐滴添加預(yù)溫培養(yǎng)基→低速離心去DMSO”的步驟，避免細(xì)胞膜損傷。復(fù)蘇后48小時(shí)不用去動(dòng)細(xì)胞。細(xì)胞會(huì)緩慢貼壁后成塊狀增殖生長(zhǎng)起來(lái)。
2、傳代密度與時(shí)間控制
1）傳代密度：建議接種密度為2-4×10⁴ cells/cm²，密度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)增殖期，密度過(guò)高易導(dǎo)致堆積分化異常。
2）傳代間隔：通常每3-5天傳代一次（80-90%融合時(shí)），因其增殖速度較慢，切勿頻繁操作。
3、消化技巧
由于消化時(shí)間比較長(zhǎng)，盡量在胰酶的作用下充分消化脫落，減少吹打?qū)?xì)胞帶來(lái)的機(jī)械損傷。以下是我司的消化技巧：建議消化前用pbs多洗幾次，約2-4次，每次3-5ml,盡量去除干凈pbs后，加入2ml的0.25%胰酶（+0.02% EDTA），放入培養(yǎng)箱5-8min左右，從培養(yǎng)箱拿出，用手掌心拍打瓶尾部，觀察細(xì)胞脫落情況，(沒(méi)有脫落繼續(xù)放入培養(yǎng)箱)直到顯微鏡下觀察細(xì)胞成流沙狀態(tài)脫落約80%左右，加入3-5ml完全培養(yǎng)基終止消化。使用巴氏吸管輕柔吹打瓶?jī)?nèi)各部位約4-6下，收集細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘.去除上清液，細(xì)胞沉淀用手指波動(dòng)彈松后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行分瓶。（以上體積是T25瓶的添加量）。
二、 分化培養(yǎng)：
Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)主要包括將細(xì)胞培養(yǎng)在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成連續(xù)的單層，從而模擬腸上皮屏障的功能。Caco-2細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，會(huì)自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)和功能。
分化培養(yǎng)的具體步驟和條件1：
1、培養(yǎng)基選擇：Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)通常采用5.55 mM D-葡萄糖 EMEM 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10%的胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S）以支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和防止污染。具體而言，5.55 mM D-葡萄糖 EMEM培養(yǎng)基中需加入10%的FBS和1%的P/S，以確保細(xì)胞獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，同時(shí)維持無(wú)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、 細(xì)胞接種：將Caco-2細(xì)胞接種在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成單層細(xì)胞。
3、分化條件：細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)發(fā)生分化和極化，轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谂帕性谛∧c中的腸細(xì)胞，具有腸上皮細(xì)胞樣緊密連接、微絨毛、酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等特性。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
1、細(xì)胞不貼壁
當(dāng)Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)基中的胎牛血清比例降至10%時(shí)，細(xì)胞的貼壁性會(huì)明顯下降。為了解決這個(gè)問(wèn)題，建議使用高質(zhì)量的胎牛血清，并確保血清比例不低于20%。
2、細(xì)胞難以消化
Caco-2細(xì)胞的連接非常緊密，消化時(shí)間通常需要5-10分鐘。在消化過(guò)程中，細(xì)胞往往難以被吹散為單個(gè)細(xì)胞，通常形成小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。
3、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
Caco-2細(xì)胞的倍增時(shí)間約為72小時(shí)，傳代周期較長(zhǎng)，通常約一周傳代一次。細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)都較為緩慢，建議接種后等待48小時(shí)以上完成貼壁。
4、細(xì)胞老化
Caco-2細(xì)胞容易老化，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)許多空泡和黑點(diǎn)。這可能是由于細(xì)胞裂解或污染所致。建議定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件，必要時(shí)進(jìn)行傳代或更換培養(yǎng)基。
5、支原體污染
Caco-2細(xì)胞容易受到支原體污染，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑膠蟲(chóng)。這通常需要重新培養(yǎng)或更換培養(yǎng)環(huán)境。
解決方法：1）調(diào)整培養(yǎng)條件：確保使用高質(zhì)量的胎牛血清，并調(diào)整血清比例至20%以上，以改善細(xì)胞的貼壁性。2）優(yōu)化消化過(guò)程：在消化過(guò)程中分次進(jìn)行，確保細(xì)胞能夠被吹散為小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。3）控制細(xì)胞密度和傳代頻率：避免頻繁傳代，確保細(xì)胞在80%密度時(shí)進(jìn)行傳代，以維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。4）定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件：定期檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常，及時(shí)處理污染問(wèn)題。
參考文獻(xiàn)：
1. Harleen Kaur , Régis Moreau .mTORC1 silencing during intestinal epithelial Caco-2 cell differentiation is mediated by the activation of the AMPK/TSC2 pathway.
細(xì)胞來(lái)源
Caco-2細(xì)胞是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，最初是從一位72歲男性患者的直腸原位癌組織中分離出來(lái)建立的。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，能夠分化成類似小腸上皮細(xì)胞的形態(tài)，表現(xiàn)出微絨毛等結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，可表現(xiàn)出具有分化的腸上皮細(xì)胞的特征。Caco-2細(xì)胞因其與小腸上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，被廣泛用于模擬體內(nèi)腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)。因其在模擬人類腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的能力，已成為研究藥物代謝和口服生物利用度的重要工具。細(xì)胞表達(dá)維甲酸結(jié)合蛋白I和維甲酸結(jié)合蛋白II。
中喬新舟出庫(kù)圖 4X
中喬新舟出庫(kù)圖10X
Caco-2細(xì)胞特性：
培養(yǎng)條件：RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（中喬新舟 貨號(hào)：ZQ-200）+10%胎牛血清 (中喬新舟 貨號(hào)：ZQ0500）+1%P/S（貨號(hào)：CSP006）或者完全培養(yǎng)基（ZM0056）
Caco-2細(xì)胞專用培養(yǎng)基已包含成分包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗等細(xì)胞生長(zhǎng)需要的其他添加物。由中喬新舟技術(shù)團(tuán)隊(duì)精心優(yōu)化，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期測(cè)試，可保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
倍增時(shí)間：大約32~80小時(shí)
消化時(shí)間： 5-15 min
傳代頻率：1：2傳代3天可再次傳代
l 復(fù)蘇或傳代后細(xì)胞貼壁較慢，大量細(xì)胞會(huì)漂浮并存在一些碎片，最終會(huì)以島狀形態(tài)貼壁并擴(kuò)散生長(zhǎng)。為了避免干擾細(xì)胞貼壁，48小時(shí)內(nèi)不要換液。
l 細(xì)胞形態(tài)不均一，有一些含有液泡的巨大細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有黑色顆粒物，屬正�，F(xiàn)象。
l 該細(xì)胞對(duì)血清質(zhì)量較為敏感，我司建議您使用品牌優(yōu)質(zhì)胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)或選擇訂購(gòu)我司配套Caco-2完全培養(yǎng)液。
一、 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代
1、快速解凍，減少應(yīng)激
Caco-2細(xì)胞對(duì)溫度敏感，需嚴(yán)格遵循“37℃水浴快速解凍→逐滴添加預(yù)溫培養(yǎng)基→低速離心去DMSO”的步驟，避免細(xì)胞膜損傷。復(fù)蘇后48小時(shí)不用去動(dòng)細(xì)胞。細(xì)胞會(huì)緩慢貼壁后成塊狀增殖生長(zhǎng)起來(lái)。
2、傳代密度與時(shí)間控制
1）傳代密度：建議接種密度為2-4×10⁴ cells/cm²，密度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)增殖期，密度過(guò)高易導(dǎo)致堆積分化異常。
2）傳代間隔：通常每3-5天傳代一次（80-90%融合時(shí)），因其增殖速度較慢，切勿頻繁操作。
3、消化技巧
由于消化時(shí)間比較長(zhǎng)，盡量在胰酶的作用下充分消化脫落，減少吹打?qū)?xì)胞帶來(lái)的機(jī)械損傷。以下是我司的消化技巧：建議消化前用pbs多洗幾次，約2-4次，每次3-5ml,盡量去除干凈pbs后，加入2ml的0.25%胰酶（+0.02% EDTA），放入培養(yǎng)箱5-8min左右，從培養(yǎng)箱拿出，用手掌心拍打瓶尾部，觀察細(xì)胞脫落情況，(沒(méi)有脫落繼續(xù)放入培養(yǎng)箱)直到顯微鏡下觀察細(xì)胞成流沙狀態(tài)脫落約80%左右，加入3-5ml完全培養(yǎng)基終止消化。使用巴氏吸管輕柔吹打瓶?jī)?nèi)各部位約4-6下，收集細(xì)胞懸液離心，1000轉(zhuǎn)5分鐘.去除上清液，細(xì)胞沉淀用手指波動(dòng)彈松后加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行分瓶。（以上體積是T25瓶的添加量）。
二、 分化培養(yǎng)：
Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)主要包括將細(xì)胞培養(yǎng)在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成連續(xù)的單層，從而模擬腸上皮屏障的功能。Caco-2細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下匯合后，會(huì)自發(fā)分化為腸上皮樣細(xì)胞，具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)和功能。
分化培養(yǎng)的具體步驟和條件1：
1、培養(yǎng)基選擇：Caco-2細(xì)胞的分化培養(yǎng)通常采用5.55 mM D-葡萄糖 EMEM 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10%的胎牛血清（FBS）和雙抗（青霉素/鏈霉素，P/S）以支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和防止污染。具體而言，5.55 mM D-葡萄糖 EMEM培養(yǎng)基中需加入10%的FBS和1%的P/S，以確保細(xì)胞獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，同時(shí)維持無(wú)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、 細(xì)胞接種：將Caco-2細(xì)胞接種在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上，形成單層細(xì)胞。
3、分化條件：細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)時(shí)，會(huì)發(fā)生分化和極化，轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谂帕性谛∧c中的腸細(xì)胞，具有腸上皮細(xì)胞樣緊密連接、微絨毛、酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等特性。
三、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案
1、細(xì)胞不貼壁
當(dāng)Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)基中的胎牛血清比例降至10%時(shí)，細(xì)胞的貼壁性會(huì)明顯下降。為了解決這個(gè)問(wèn)題，建議使用高質(zhì)量的胎牛血清，并確保血清比例不低于20%。
2、細(xì)胞難以消化
Caco-2細(xì)胞的連接非常緊密，消化時(shí)間通常需要5-10分鐘。在消化過(guò)程中，細(xì)胞往往難以被吹散為單個(gè)細(xì)胞，通常形成小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。
3、細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢
Caco-2細(xì)胞的倍增時(shí)間約為72小時(shí)，傳代周期較長(zhǎng)，通常約一周傳代一次。細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)都較為緩慢，建議接種后等待48小時(shí)以上完成貼壁。
4、細(xì)胞老化
Caco-2細(xì)胞容易老化，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)許多空泡和黑點(diǎn)。這可能是由于細(xì)胞裂解或污染所致。建議定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件，必要時(shí)進(jìn)行傳代或更換培養(yǎng)基。
5、支原體污染
Caco-2細(xì)胞容易受到支原體污染，表現(xiàn)為細(xì)胞中出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑膠蟲(chóng)。這通常需要重新培養(yǎng)或更換培養(yǎng)環(huán)境。
解決方法：1）調(diào)整培養(yǎng)條件：確保使用高質(zhì)量的胎牛血清，并調(diào)整血清比例至20%以上，以改善細(xì)胞的貼壁性。2）優(yōu)化消化過(guò)程：在消化過(guò)程中分次進(jìn)行，確保細(xì)胞能夠被吹散為小的細(xì)胞團(tuán)塊即可終止消化。3）控制細(xì)胞密度和傳代頻率：避免頻繁傳代，確保細(xì)胞在80%密度時(shí)進(jìn)行傳代，以維持細(xì)胞的健康狀態(tài)。4）定期檢查培養(yǎng)環(huán)境和條件：定期檢查培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)環(huán)境是否出現(xiàn)異常，及時(shí)處理污染問(wèn)題。
參考文獻(xiàn)：
1. Harleen Kaur , Régis Moreau .mTORC1 silencing during intestinal epithelial Caco-2 cell differentiation is mediated by the activation of the AMPK/TSC2 pathway.
- SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇和常見(jiàn)問(wèn)題解答
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