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《Nature》文獻分享:光片超分辨成像追蹤活細胞動態(tài)結(jié)構(gòu)

瀏覽次數(shù):361 發(fā)布日期:2025-6-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

光片熒光顯微術(shù)(LSFM)憑借高速三維成像和低光損傷特性,成為多細胞系統(tǒng)四維生物學成像的重要工具,但其光片厚度通常大于1微米,難以解析活細胞內(nèi)亞微米級精細結(jié)構(gòu)。本文聚焦瑞典皇家理工學院研究團隊開發(fā)的多片層可逆飽和光學熒光躍遷顯微術(shù)(Multi-sheet RESOLFT),該技術(shù)通過可逆光開關(guān)熒光蛋白(RSFPs)與周期性光開關(guān)圖案的結(jié)合,首次實現(xiàn)了亞100納米級光片厚度的超分辨斷層成像,并以1–2Hz的高速完成三維體積采集,為動態(tài)追蹤細胞分裂、肌動蛋白運動及病毒樣顆粒行為提供了全新視角。

重要發(fā)現(xiàn)者為Andreas Bodén、Ilaria Testa等,研究成果以《Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy》為題,發(fā)表在《Nature Methods》雜志。

重要發(fā)現(xiàn)
01傳統(tǒng)光片成像的瓶頸與突破思路
傳統(tǒng)光片顯微術(shù)(如斜平面顯微鏡OPM)受光的衍射特性限制,即使采用高數(shù)值孔徑物鏡(NA~1.3),光片厚度也難以突破1–2微米,導致相鄰亞細胞結(jié)構(gòu)(如間隔<1微米的細胞膜)在成像中嚴重模糊。為解決這一問題,研究團隊引入可逆飽和光學熒光躍遷(RESOLFT)原理,利用RSFPs的“開-關(guān)”雙穩(wěn)態(tài)特性——通過405nm寬場光將所有熒光蛋白激活為“開”狀態(tài),再以488nm正弦干涉圖案光(周期1.2微米,傾斜35°)精準關(guān)閉大部分區(qū)域的熒光,僅保留納米級厚度的發(fā)光片層。

02多片層并行化成像的核心機制
多片層RESOLFT的關(guān)鍵在于“光片印記-快速讀取”的創(chuàng)新流程:
光片印記:通過調(diào)節(jié)“關(guān)閉光”的功率和持續(xù)時間,可將發(fā)光片層厚度壓縮至100–200納米,較傳統(tǒng)OPM光片薄10倍以上(圖1b)。
快速讀取:使用488nm光片逐片激發(fā)印記的發(fā)光層,通過匹配光片間距與讀取光的艾里斑零強度點,避免相鄰層串擾。單次體積成像僅需10–20次熒光開關(guān)循環(huán),顯著降低光漂白風險。

03實驗驗證:從模擬到活細胞的動態(tài)成像
在虛擬多膜結(jié)構(gòu)模擬中(圖2a),傳統(tǒng)OPM無法區(qū)分間隔500納米的三層膜,而多片層RESOLFT通過超分辨斷層清晰解析了各層結(jié)構(gòu)。在活細胞實驗中,研究團隊利用MAP2-rsEGFP(N205S)標記微管,實現(xiàn)了軸向分辨率<200納米的三維成像(圖3),并以2秒/體積的速度追蹤肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)30分鐘(圖4),信號衰減僅25%。

此外,該技術(shù)成功記錄了HeLa細胞4小時內(nèi)的分裂全過程(圖5),以及病毒樣顆粒在細胞膜表面的動態(tài)聚集(圖6),展現(xiàn)了其在動態(tài)生物學研究中的強大潛力。

創(chuàng)新與亮點
01突破衍射極限的“納米級光片”
傳統(tǒng)光片成像的分辨率由光片厚度和檢測系統(tǒng)共同決定,而多片層RESOLFT通過光學調(diào)控熒光蛋白開關(guān)狀態(tài),繞過了光的物理衍射限制。實驗顯示,其有效光片厚度可穩(wěn)定控制在100–200納米,使三維體積分辨率達到250納米以下(x/y/z軸),首次在光片技術(shù)中實現(xiàn)了“超分辨斷層”能力。

02高速與低損傷的完美平衡
相比傳統(tǒng)超分辨技術(shù)(如STED)需要數(shù)百次開關(guān)循環(huán),多片層RESOLFT將單次體積成像的循環(huán)次數(shù)壓縮至10–20次,結(jié)合0.7秒/體積的超快采集速度,顯著降低了光毒性。這使得長達數(shù)小時的活細胞延時成像成為可能,例如連續(xù)4小時追蹤細胞分裂過程中染色體的動態(tài)變化(圖5),而傳統(tǒng)方法因光損傷難以實現(xiàn)。

03兼容性與多功能拓展
該技術(shù)對RSFPs的開關(guān)循環(huán)次數(shù)要求極低,可兼容rsEGFP2、rsEGFP(N205S)等多種熒光蛋白,并支持多色成像拓展。此外,其光學系統(tǒng)基于商用組件構(gòu)建(僅衍射光柵需定制),兼容標準蓋玻片,為高通量活細胞成像奠定了基礎(chǔ)。

總結(jié)與展望
多片層RESOLFT顯微術(shù)通過光片技術(shù)與超分辨原理的跨維度融合,突破了傳統(tǒng)光學成像在分辨率、速度與光損傷之間的固有矛盾,為解析亞細胞結(jié)構(gòu)的時空動態(tài)提供了革命性工具。當前技術(shù)已實現(xiàn)140×84×15微米³體積的高速成像,未來通過升級激光器功率和相機靈敏度,有望將采集速度提升至0.5秒/體積以下,并進一步拓展至更大樣本(如類器官)和更深組織(需結(jié)合像差校正技術(shù))。

在應(yīng)用層面,該技術(shù)可廣泛用于腫瘤細胞遷移機制、病毒組裝路徑、細胞器互作網(wǎng)絡(luò)等前沿領(lǐng)域,甚至為實時監(jiān)測藥物對亞細胞結(jié)構(gòu)的動態(tài)影響提供可能。隨著RSFPs光譜多樣性的提升和自動化算法的優(yōu)化,多片層RESOLFT或?qū)⑼苿庸馄上駨?ldquo;宏觀觀察”邁向“納米級動態(tài)解析”,成為連接分子生物學與細胞生物學的關(guān)鍵橋梁。

正如研究團隊在討論中指出,這項技術(shù)不僅是光學成像的一次技術(shù)突破,更預示著“智能光片”時代的到來——通過動態(tài)調(diào)控光開關(guān)圖案與熒光蛋白行為,未來的光片顯微鏡或?qū)崿F(xiàn)分辨率、速度與成像深度的按需切換,為生命科學研究帶來無限想象空間。

論文信息
聲明:本文僅用作學術(shù)目的。
Bodén A, Ollech D, York AG, Millett-Sikking A, Testa I. Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy. 

DOI:10.1038/s41592-024-02196-8.

發(fā)布者:羅輯技術(shù)(武漢)有限公司
聯(lián)系電話:13260667811
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