AAV9-Lyz2對骨髓巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響
外周動脈疾病（PAD）是在老年群體中常見的血管疾病，治療性血管再生（血管生成和動脈生成）是潛在療法，但臨床進(jìn)展不理想，可能與未考慮衰老對血管再生的影響有關(guān)。巨噬細(xì)胞在血管再生中起關(guān)鍵作用，衰老微環(huán)境使招募的單核/巨噬細(xì)胞更易衰老，但其在老年個體缺血肌肉中的特征及機(jī)制尚不明確。VEGF-A的剪接異構(gòu)體VEGF-A165B具有抗血管生成作用，但其在衰老過程中的變化未被充分研究。2025年4月17日，湖南省婦幼保健院黃群教授研究團(tuán)隊(duì)在AGING CELL（IF 8）期刊發(fā)文“Senescent Macrophages Promote Age-Related Revascularization Impairment by Increasing Antiangiogenic VEGF-A165B Expression”。研究發(fā)現(xiàn)老年小鼠缺血后肢骨骼肌中的巨噬細(xì)胞更易衰老且促炎，衰老巨噬細(xì)胞通過增加抗血管生成的VEGF-A165B表達(dá)和分泌，抑制血管再生并誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，提示靶向衰老巨噬細(xì)胞可能是改善年齡相關(guān)血管再生損傷的一種有效治療方法。
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基因信息：Vegf-a165b：血管內(nèi)皮生長因子a-165b
病毒產(chǎn)品：AAV9-Lyz2-shVegf-a165b、AAV9-Scramble
實(shí)驗(yàn)動物：24月齡小鼠
注射部位：腿部骨髓
病毒用量：5×10^10 vg/leg
研究結(jié)果
1、老年小鼠缺血骨骼肌中巨噬細(xì)胞向衰老表型發(fā)展
研究團(tuán)隊(duì)對年輕（2月齡）和老年（24月齡）小鼠缺血后肢骨骼肌巨噬細(xì)胞進(jìn)行RNA測序，發(fā)現(xiàn)734個差異表達(dá)基因（DEGs），其中30個與細(xì)胞衰老相關(guān)，KEGG和GO分析表明，DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞衰老、免疫系統(tǒng)過程和炎癥反應(yīng)等通路。免疫熒光結(jié)果顯示，老年小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力減弱，DNA損傷嚴(yán)重，與衰老細(xì)胞的特征相符。通過基于SPiDER-βGal熒光探針的流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)老年小鼠缺血骨骼肌中，總巨噬細(xì)胞以及CD86⁺或CD206⁺巨噬細(xì)胞的SA-β-gal 活性（SPiDER-βGal 信號）高表達(dá)，且老年組SPiDER-β-Gal⁺巨噬細(xì)胞總數(shù)和CD86⁺SPiDER-β-Gal⁺巨噬細(xì)胞數(shù)量更多。此外，對老年小鼠缺血骨骼肌中的非衰老（non-SMPs）和衰老巨噬細(xì)胞（SMPs）進(jìn)行分選和分析，結(jié)果顯示SMPs中衰老相關(guān)蛋白P16、P21表達(dá)增加，LMNB1表達(dá)減少，同時MHCII和LYVE1蛋白水平升高，這些數(shù)據(jù)表明年齡促進(jìn)缺血性骨骼肌中的巨噬細(xì)胞向衰老表型發(fā)展。
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基因信息：Vegf-a165b：血管內(nèi)皮生長因子a-165b
病毒產(chǎn)品：AAV9-Lyz2-shVegf-a165b、AAV9-Scramble
實(shí)驗(yàn)動物：24月齡小鼠
注射部位：腿部骨髓
病毒用量：5×10^10 vg/leg
研究結(jié)果
1、老年小鼠缺血骨骼肌中巨噬細(xì)胞向衰老表型發(fā)展
研究團(tuán)隊(duì)對年輕（2月齡）和老年（24月齡）小鼠缺血后肢骨骼肌巨噬細(xì)胞進(jìn)行RNA測序，發(fā)現(xiàn)734個差異表達(dá)基因（DEGs），其中30個與細(xì)胞衰老相關(guān)，KEGG和GO分析表明，DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞衰老、免疫系統(tǒng)過程和炎癥反應(yīng)等通路。免疫熒光結(jié)果顯示，老年小鼠巨噬細(xì)胞增殖能力減弱，DNA損傷嚴(yán)重，與衰老細(xì)胞的特征相符。通過基于SPiDER-βGal熒光探針的流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)老年小鼠缺血骨骼肌中，總巨噬細(xì)胞以及CD86⁺或CD206⁺巨噬細(xì)胞的SA-β-gal 活性（SPiDER-βGal 信號）高表達(dá)，且老年組SPiDER-β-Gal⁺巨噬細(xì)胞總數(shù)和CD86⁺SPiDER-β-Gal⁺巨噬細(xì)胞數(shù)量更多。此外，對老年小鼠缺血骨骼肌中的非衰老（non-SMPs）和衰老巨噬細(xì)胞（SMPs）進(jìn)行分選和分析，結(jié)果顯示SMPs中衰老相關(guān)蛋白P16、P21表達(dá)增加，LMNB1表達(dá)減少，同時MHCII和LYVE1蛋白水平升高，這些數(shù)據(jù)表明年齡促進(jìn)缺血性骨骼肌中的巨噬細(xì)胞向衰老表型發(fā)展。
骨骼肌巨噬細(xì)胞的增齡性改變
2.衰老巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙依賴于VEGF-A165B
通過巨噬細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)衰老巨噬細(xì)胞對年輕小鼠血管再生具有抑制作用，并與EC功能障礙密切相關(guān)。數(shù)據(jù)顯示，衰老巨噬細(xì)胞中，抗血管生成的VEGF-A165B mRNA和蛋白水平顯著升高，而促血管生成的VEGF-A165A無明顯變化。使用siRNA敲低衰老BMDMs的VEGF-A165B，或用VEGF-A165B抗體中和S-CM中的該因子，均可恢復(fù)ECs的主動脈環(huán)發(fā)芽、遷移、管形成能力及NO生成，表明衰老的巨噬細(xì)胞部分地通過增加VEGF-A165 B的表達(dá)和分泌來影響EC的功能。通過AAV9介導(dǎo)的Vegf-a165b基因敲低，在老年小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中特異性抑制 VEGF-A165B表達(dá)，隨后將分離的衰老巨噬細(xì)胞移植到年輕小鼠后肢缺血模型中，與移植未敲低VEGF-A165B的衰老巨噬細(xì)胞相比，敲低組（AAV-shVegf-a165b SMPs）的年輕小鼠后肢血流灌注顯著恢復(fù)，接近非衰老巨噬細(xì)胞移植組水平。此外，敲低組血管結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞功能有所改善。表明VEGF-A165 B介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞在年齡誘導(dǎo)的肌肉血管重建損傷和EC功能障礙中的作用。進(jìn)一步分析證明老年P(guān)AD患者血漿VEGF-A165 B水平升高并與PAD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
2.衰老巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙依賴于VEGF-A165B
通過巨噬細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)衰老巨噬細(xì)胞對年輕小鼠血管再生具有抑制作用，并與EC功能障礙密切相關(guān)。數(shù)據(jù)顯示，衰老巨噬細(xì)胞中，抗血管生成的VEGF-A165B mRNA和蛋白水平顯著升高，而促血管生成的VEGF-A165A無明顯變化。使用siRNA敲低衰老BMDMs的VEGF-A165B，或用VEGF-A165B抗體中和S-CM中的該因子，均可恢復(fù)ECs的主動脈環(huán)發(fā)芽、遷移、管形成能力及NO生成，表明衰老的巨噬細(xì)胞部分地通過增加VEGF-A165 B的表達(dá)和分泌來影響EC的功能。通過AAV9介導(dǎo)的Vegf-a165b基因敲低，在老年小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中特異性抑制 VEGF-A165B表達(dá)，隨后將分離的衰老巨噬細(xì)胞移植到年輕小鼠后肢缺血模型中，與移植未敲低VEGF-A165B的衰老巨噬細(xì)胞相比，敲低組（AAV-shVegf-a165b SMPs）的年輕小鼠后肢血流灌注顯著恢復(fù)，接近非衰老巨噬細(xì)胞移植組水平。此外，敲低組血管結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，內(nèi)皮細(xì)胞功能有所改善。表明VEGF-A165 B介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞在年齡誘導(dǎo)的肌肉血管重建損傷和EC功能障礙中的作用。進(jìn)一步分析證明老年P(guān)AD患者血漿VEGF-A165 B水平升高并與PAD嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
VEGF-A165B基因敲減對衰老巨噬細(xì)胞在缺血誘導(dǎo)的血管重建損傷中的作用
研究結(jié)論
本研究首次揭示了衰老的巨噬細(xì)胞在年齡相關(guān)的血管重建損傷中的重要作用，其潛在機(jī)制涉及衰老的巨噬細(xì)胞高表達(dá)抗血管生成亞型VEGF-A165B，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，表明靶向衰老巨噬細(xì)胞可能是PAD臨床治療的一個有前途的方向。
本研究首次揭示了衰老的巨噬細(xì)胞在年齡相關(guān)的血管重建損傷中的重要作用，其潛在機(jī)制涉及衰老的巨噬細(xì)胞高表達(dá)抗血管生成亞型VEGF-A165B，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，表明靶向衰老巨噬細(xì)胞可能是PAD臨床治療的一個有前途的方向。
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