細(xì)胞代謝組學(xué)分析

  代謝組學(xué)主要是對(duì)特定條件下或某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行的分析, 因細(xì)胞內(nèi)酶系活躍、代謝轉(zhuǎn)換迅速, 取樣和樣品制備方法顯著影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性。因此, 做好樣品的前處理是取得可靠分析結(jié)果的先決條件。根據(jù)研究對(duì)象、目的和分析技術(shù)的不同, 對(duì)樣品的前處理要求也不一致, 不存在一種普適性的方法, 樣品處理方法大致分為兩步: 細(xì)胞淬滅和代謝物提取。

  淬滅也稱為“滅活”, 目的是讓細(xì)胞內(nèi)的酶失活, 保證代謝物的輪廓“凍結(jié)”。對(duì)于胞內(nèi)代謝物, 由于采樣或脫離培養(yǎng)環(huán)境后細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的變化, 造成代謝物種類及含量也隨之發(fā)生變化, 為了正確反映培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞代謝物的真實(shí)信息, 需要立即淬滅細(xì)胞, 終止胞內(nèi)反應(yīng)。理想的淬滅技術(shù)應(yīng)在保持細(xì)胞完整性的基礎(chǔ)上確保酶迅速失活。淬滅 方法包括液氮冷凍法、酸堿滅活法、快速過(guò)濾法、低溫離心法、細(xì)胞刮法、冷甲醇法等。采用低溫離心法及細(xì)胞刮法淬滅多種貼壁哺乳細(xì)胞, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫離心可引起細(xì)胞內(nèi)大量代謝物的泄漏, 不適于代謝組學(xué)研究, 而細(xì)胞刮法較為理想。

  研究發(fā)現(xiàn), 淬滅過(guò)程會(huì)導(dǎo)致泄漏即細(xì)胞內(nèi)代謝物的丟失, 且泄漏的程度與淬滅時(shí)間、溫度及加入的淬滅試劑量等有關(guān); 隨著淬滅劑的加入、淬滅時(shí)間減少、離心速度加快, 泄漏程度會(huì)減輕。既然代謝物泄漏在所難免, 在進(jìn)行樣品前處理時(shí)應(yīng)盡量將泄漏的影響降到最低, 并注意平行操作, 快速淬滅后, 迅速低溫離心收集樣品。另外, 由于受細(xì)胞種類或分析技術(shù)的影響, 不同淬滅方法效果可能存在差異, 在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)做全面考察, 選擇最佳淬滅方法。

代謝物提取 一旦代謝反應(yīng)通過(guò)滅活被停止, 代謝產(chǎn)物就需要從細(xì)胞中提取出來(lái)。根據(jù)細(xì)胞代謝組學(xué)研究層次不同, 提取方法及要求也不同。如在靶 標(biāo)分析中, 需要采用特定的方法有選擇性地提取出相應(yīng)的組分; 而在輪廓分析中, 則需盡可能提取出多種代謝物。目前許多研究者以細(xì)胞能量代謝中間產(chǎn) 物的量為指標(biāo), 對(duì)多種提取方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察, 但因各細(xì)胞株種類、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成及細(xì)胞生理?xiàng)l件等不同, 造成代謝物水平差異較大, 至今仍沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法, 實(shí)際中應(yīng)根據(jù)化合物及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌�選擇相應(yīng)的提取方法。一般提取時(shí)應(yīng)遵循以 下原則: ① 以適當(dāng)?shù)幕厥章蕪募?xì)胞中提取最大量的代謝產(chǎn)物; ② 代謝物不應(yīng)該遭遇任何理化修飾, 將降解控制在最小范圍內(nèi); ③ 防止代謝物泄漏; ④ 具有非破壞性。

從不同分析角度觀測(cè)

1、代謝靶向分析

代謝靶向分析是針對(duì)某個(gè)或某幾個(gè)特定組分的定量分析。因其焦點(diǎn)為特定化合物的分析,通常忽略其他大量的代謝組信息, 故需要采用具有選擇性的樣品制備技術(shù)除去干擾物, 或選擇一定的數(shù)據(jù)預(yù)處理技術(shù)去除干擾物色譜峰, 優(yōu)化數(shù)據(jù)質(zhì)量, 提高方法靈敏度和代謝物濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性。但當(dāng)目標(biāo)物處 于重疊色譜峰中時(shí), 需借助專門的化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)進(jìn)行解析, 如平行因子分析法、多元曲線分辨−交互最小二乘法 (MCR-ALS) 等。目前, 該研究主要集中于與癌細(xì)胞能量代謝相關(guān)的化合物研究, 如核苷類、氨基酸類、脂類、糖類等。

1. 代謝輪廓分析

代謝輪廓分析是對(duì)預(yù)設(shè)的一些代謝產(chǎn)物的定量分析, 如某一結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)相似的化合物、預(yù)先選擇的某些代謝途徑的所有中間產(chǎn)物、多條代謝途徑中的標(biāo)志性組分等, 是對(duì)大范圍內(nèi)的代謝物進(jìn)行檢測(cè), 目的是獲得一套完整的、綜合的代謝組輪廓, 以便更直觀地理解參與代謝的化合物之間以及所有酶之間的相互作用, 是對(duì)細(xì)胞代謝的抽象表達(dá)。目前, 采用基于NMR法的代謝輪廓分析已尋找出多種與能量代謝相關(guān)的標(biāo)記物, 主要涉及到糖酵解、三羧酸循環(huán)、膽堿和脂肪酸代謝等, 在癌癥診斷和治療方面扮演著重要角色。此外, 國(guó)內(nèi)外許多研究者對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的代謝輪廓與細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究, 但細(xì)胞內(nèi)的代謝組不是靜態(tài)的, 不同個(gè)體對(duì)外界擾動(dòng)所作出的響應(yīng)也存在較大的差異, 使得代謝物的準(zhǔn)確測(cè)定及其與疾病的相關(guān)性研究仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。

1. 代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)分析是采用高通量的分析技術(shù)對(duì)限定條件下的特定生物樣品中代謝組分的定性和定量, 即整體性地分析生物體對(duì)內(nèi)外因素做出動(dòng)態(tài)應(yīng)答的所有代謝物小分子。生物體在受到外源性干擾后, 其所處的內(nèi)環(huán)境也相應(yīng)的發(fā)生改變, 原本正常的代謝狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。在細(xì)胞研究的層面上, 其研究的是細(xì)胞受到外界擾動(dòng)后胞內(nèi)所有代謝物的綜合表現(xiàn)——全局觀點(diǎn), 通常采用現(xiàn)代分析方法、計(jì)算機(jī)技術(shù)及統(tǒng)計(jì)方法, 以高通量實(shí)驗(yàn)和大規(guī)模的計(jì)算為特點(diǎn), 尋找生物體應(yīng)激前后代謝差異, 進(jìn)而確定與疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物。

任何預(yù)測(cè)藥物吸收、分布、代謝、排泄以及毒性評(píng)價(jià)成功的技術(shù)都需要關(guān)聯(lián)內(nèi)源性物質(zhì)代謝變化來(lái)考慮藥物的代謝情況, 因此通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)不僅可研究藥物本身的代謝, 還可研究藥物及其他外界刺激引起的內(nèi)源性代謝組的變化, 更能直接地反映體內(nèi)生化過(guò)程, 闡明藥物靶點(diǎn)或作用機(jī)制。

癌細(xì)胞具有旺盛的代謝狀態(tài), 而癌癥的發(fā)生、發(fā)展亦離不開(kāi)細(xì)胞周圍的微環(huán)境。腫瘤生長(zhǎng)所依賴的微環(huán)境主要包括葡萄糖、氧分及其他營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)因子, 并呈現(xiàn)出明顯的酸性, 而乳酸鹽等一些小分子物質(zhì)是構(gòu)成這種酸性環(huán)境的主要成分, 因此乳酸鹽含量增加也預(yù)示著癌癥的發(fā)生。目前, 國(guó)內(nèi)外許多研究者考察了多種外界擾動(dòng) (如低氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、藥物等) 對(duì)細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及代謝關(guān)鍵酶活性等的影響。

1. 代謝足跡分析

研究表明, 生物體在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量代謝物, 特別在不平衡生長(zhǎng)條件下, 能分泌許多具有生理活性的初級(jí)和次級(jí)代謝物以及信號(hào)分子, 這種分泌過(guò)程能清晰地反映細(xì)胞的代謝活動(dòng)以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平, 即細(xì)胞外代謝組學(xué)。該分析技術(shù)已成功應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中, 是由英國(guó)科學(xué)家 Kell等在2003年首先設(shè)計(jì)出的一種用于代謝組學(xué)細(xì)胞功能分析的新技術(shù), 其采用直接注射質(zhì)譜技術(shù), 以細(xì)胞培養(yǎng)液為分析對(duì)象, 監(jiān)控細(xì)胞從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中消耗營(yíng)養(yǎng)物以及分泌代謝物質(zhì)培養(yǎng)基的全部過(guò)程。Kell將其定義為細(xì)胞外代謝組學(xué), Nielsen和Oliver 等引入Endo-Metabolome和Exo-Metabolome術(shù)語(yǔ)以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)、外代謝物。該分析技術(shù)可與細(xì)胞內(nèi)代謝組研究相互補(bǔ)充, 為進(jìn)一步完善代謝組學(xué)的研究范圍打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

代謝足跡分析與前述細(xì)胞內(nèi)代謝物的分析不同, 具有以下特點(diǎn): ① 樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)便, 無(wú)需淬滅及提取步驟; 因細(xì)胞內(nèi)代謝物是動(dòng)態(tài)的, 且大多數(shù)代謝物的轉(zhuǎn)換速度極快, 從幾秒鐘至幾分鐘, 故需快速淬滅細(xì)胞以凍結(jié)新陳代謝, 再采用一定的方法提取代謝物, 上述實(shí)驗(yàn)均增加了操作上的困難, 很可能造成對(duì)代謝通量的誤解; ② 胞內(nèi)某些生化反應(yīng)與胞外基質(zhì)相關(guān), 如復(fù)雜基質(zhì)的降解反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控等, 只能通過(guò)細(xì)胞外降解產(chǎn)物的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià); ③ 便于考察細(xì)胞對(duì)外界物質(zhì)的利用情況, 優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

對(duì)細(xì)胞樣本數(shù)量的要求

一般細(xì)胞量1.5*10^7及以上即可，細(xì)胞培養(yǎng)上清液200ul。

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