OneShine CRISPR lncRNA過表達(dá)細(xì)胞文庫

OneShine CRISPR/Cas9 long noncodingRNA過表達(dá)細(xì)胞文庫

一、原理

此系統(tǒng)包括lentiSAMv2質(zhì)粒和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro質(zhì)粒。lentiSAMv2質(zhì)粒如圖一所示，其中，eSpcas9(1.1)也叫做dCas9，是將Cas9酶切位點(diǎn)突變后形成的，它只具有結(jié)合基因組和sgRNA的能力，而不具備切割DNA的能力。lentiSAMv2質(zhì)粒是經(jīng)過改造的gRNA質(zhì)粒，在sgRNA后面加入了19個堿基（MS2 binding site）。這19個堿基經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后形成一個具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA，此RNA能特異性地與MS2蛋白結(jié)合。而在另一個載體上，MS2蛋白已經(jīng)與P65、HSF1蛋白融合。其中，P65、HSF1是兩個轉(zhuǎn)錄因子。因此，當(dāng)兩個載體同時進(jìn)入同一個細(xì)胞后，lentiSAMv2質(zhì)粒表達(dá)“sgRNA- MS2 binding site“融合RNA及dCas9蛋白，lenti MS2-P65-HSF1_Hygro載體表達(dá)MS2-P65-HSF1。在dCas9作用下，則形成“基因組DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2- P65-HSF1”這一超級復(fù)合體。當(dāng)sgRNA為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)時，此超級復(fù)合體定位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，由于P65、HSF1可以募集更多轉(zhuǎn)錄因子，因此可啟動轉(zhuǎn)錄，從而激活轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后面的基因表達(dá)。

我們合成了9萬多個long noncoding RNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的sgRNA（對應(yīng)1萬多個lncRNA），分別載入lentiSAMv2質(zhì)粒中，再把此9萬多個質(zhì)�；旌掀饋�，形成文庫。并且我們將此文庫整合到了細(xì)胞中，一個125cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中含有約10^8個細(xì)胞，每個細(xì)胞被激活一個lncRNA，共約1萬個lncRNA被激活，所以含有每個特定基因缺陷的細(xì)胞約有10000個（10^8/1萬）。

二、參數(shù)

靶基因物種：人

lncRNA數(shù)目：10,504

gRNA數(shù)目：96,458

細(xì)胞類型：胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等癌細(xì)胞系和永生化的細(xì)胞系。

價格：7萬元/株

三、應(yīng)用

【應(yīng)用舉例：細(xì)胞凋亡相關(guān)long noncoding RNA篩選】

取細(xì)胞文庫進(jìn)行擴(kuò)增，然后平均分成兩份，每一份包含10^8個細(xì)胞，每個細(xì)胞被激活了一個long noncoding RNA，共約1萬個lncRNA被激活，所以含有每個特定激活lncRNA的細(xì)胞約有10000個（10^8/1萬）。向其中一份細(xì)胞中加入放線菌素D、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（A組），在另一份細(xì)胞中加入溶劑、作為對照（B組）。A組用流式細(xì)胞儀篩選出凋亡細(xì)胞A1、未凋亡細(xì)胞A2。B組用流式細(xì)胞儀篩選出凋亡細(xì)胞B1、未凋亡細(xì)胞B2。分別對A1、A2、B1、B2進(jìn)行短測序，檢測哪些lncRNA被激活了。A2中被激活的lncRNA即為能抵抗凋亡的lncRNA，B1中被激活的即為能誘導(dǎo)凋亡的lncRNA。

四、其他應(yīng)用

（1）新藥靶點(diǎn)確定與驗(yàn)證

（2）環(huán)狀RNA上游調(diào)控機(jī)制分析、下游調(diào)控機(jī)理分析

（3）Long noncoding RNA作用機(jī)制驗(yàn)證

（4）脂肪代謝機(jī)制研究

（5）干細(xì)胞自我更新、不對稱性分裂機(jī)制等。