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質粒DNA質量如何評估才可靠？

瀏覽次數(shù)：6165　發(fā)布日期：2015-1-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

質粒抽提過程中有很多步驟會影響最后的產(chǎn)量和質量，那么如何評估質粒DNA的產(chǎn)量和質量呢？

目前使用分光光度法定量質粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進行質粒DNA產(chǎn)率和質量的分析是兩種最常用的方法。

溶液中的核酸濃度可通過260 nm的吸光度方便地進行計算。A260的數(shù)值處于0.1至1.0之間時測量結果具有良好的重復性，但當A260數(shù)值小于0.1或大于1.0的時候，結果的可重復性將顯著下降。而且，3.0以上的讀值是無法使用的，它可能會潛在導致對DNA質量的低估。因此，為了獲得可靠的DNA分光光度定量結果，A260的讀值需要處于0.1至1.0之間。當檢測小量DNA時，使用瓊脂糖凝膠電泳進行的定量分析可能更為可靠。

造成較低的產(chǎn)率和質量的可能因素有很多。為了確定存在問題的環(huán)節(jié)，可于每一純化步驟都保留一小部分樣品，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

制備樣本

如各個實驗方案和下列表格中所示，從澄清裂解液（樣本1）、流出液（樣本2）、QC洗滌緩沖液的混合組分（樣本3）和QF/QN緩沖液洗脫產(chǎn)物（樣本4）中各取出部分樣品。使用1倍體積的異丙醇沉淀核酸，并使用70%的乙醇洗滌該沉淀，充分蒸干后重懸于10 µl pH8.0的TE緩沖液中。

表一瓊脂糖凝膠分析所需樣本體積

樣本	實驗方案步驟	Midi	Maxi	Mega	Giga	（極低拷貝數(shù)質粒/科斯質粒） QIAGEN-tip 100	（極低拷貝數(shù)質粒/科斯質粒）QIAGEN-tip 500
1		240 µl	120 µl	120 µl	75 µl	600 µl	750 µl
2		240 µl	120 µl	120 µl	75 µl	50 µl	24 µl
3		400 µl	240 µl	160 µl	120 µl	200 µl	120 µl
4		100 µl	60 µl	22 µl	20 µl	50 µl	30 µl
(制備產(chǎn)物占樣本量的百分比)		2%	0.40%	0.08%	0.02%	1%	0.20%

瓊脂糖凝膠分析

在1%的瓊脂糖凝膠*中，對于各個質粒純化步驟中的對應樣品各加入2 µl進行電泳。

以上信息來源于：

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/reliability%20of%20dna%20quantification%20by%20spectrophotometry/

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/agarose%20gel%20analysis%20of%20the%20purification%20procedure/