曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)-基于脾氣虛的脾陽(yáng)虛大鼠模型的復(fù)制方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究

基于脾氣虛的脾陽(yáng)虛大鼠模型的復(fù)制方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究

【摘要】　目的：研究階段式大鼠脾陽(yáng)虛證模型的復(fù)制方法及客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。方法：32 只 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和脾陽(yáng)虛證模型組（模型組），每組 16 只。模型組大鼠采用兩段式造模方法；第1 階段，即前 15 d 施加飲食不節(jié)和力竭游泳刺激；第 2 階段，即后 7 d 每日早晚 2 次灌服番瀉葉。為質(zhì)控造模過(guò)程，以臨床辨證要點(diǎn)為基礎(chǔ)，建立了大鼠脾氣虛和脾陽(yáng)虛證的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組大鼠在第 1 階段出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等癥狀，表明大鼠處于脾氣虛狀態(tài)；在第 2 階段，上述變化更加嚴(yán)重，且有畏寒、便溏等癥狀，提示大鼠處于脾陽(yáng)虛狀態(tài)。結(jié)論：本研究中采用的兩段式造模方法和模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，能夠成功復(fù)制大鼠脾陽(yáng)虛證模型。

【關(guān)鍵詞】　脾陽(yáng)虛；　脾氣虛；　動(dòng)物模型；　大鼠；　評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

脾陽(yáng)虛證是中醫(yī)證候研究的重要內(nèi)容，其大鼠模型的復(fù)制方法有單因素法和復(fù)合因素法，因后者更好地模擬了該證的病因病機(jī)，目前應(yīng)用較多，但還存在一些急需解決的問(wèn)題。首先是模型的局限性問(wèn)題。因?yàn)槠㈥?yáng)虛證的病因病機(jī)復(fù)雜，難以全面模擬，所以現(xiàn)有模型實(shí)為有限模型，并不具備脾陽(yáng)氣證的全部?jī)?nèi)涵，必須加以限定。其次是模型復(fù)制的質(zhì)控問(wèn)題。復(fù)合因素造模法多為兩段式，即先復(fù)制脾氣虛，再?gòu)?fù)制脾陽(yáng)虛，而模型評(píng)價(jià)僅涉及脾陽(yáng)虛，缺乏過(guò)程管理。為解決上述問(wèn)題，本研究先后模擬脾氣虛證和脾陽(yáng)虛證的主要病因病機(jī)，并建立了階段性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以質(zhì)控，成功復(fù)制了脾陽(yáng)虛證的有限模型，特報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組　32 只 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)于遼寧省本溪市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SCXK（遼）-2010-0001]，隨機(jī)分為對(duì)照組和脾陽(yáng)虛證模型組（模型組），每組 16 只。大鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SYXK（遼）-2013-000-9]，室溫 18~23 ℃，相對(duì)濕度 45%~55%，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2　模型復(fù)制方法　第 1 階段（phase 1， P1），按文獻(xiàn) [12] 方法復(fù)制脾氣虛證模型（飲食失節(jié)＋勞倦型），即模型組大鼠在 15 d 內(nèi)：（1）先飽食 1 d，再禁食 2 d，均不禁水，共 5 個(gè)循環(huán)；（2）每日水溫35~37 ℃游泳至力竭。第 2 階段（phase 2， P2），復(fù)制脾陽(yáng)虛證模型（苦寒瀉下型），即每日灌服 20% 番瀉葉水浸劑（2 m L/100 g），早晚各 1 次，連續(xù) 7 d。

1.3　模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)　以大鼠的生物學(xué)特征為基礎(chǔ)，根據(jù)臨床辨證要點(diǎn)，擬定脾氣虛證的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：消瘦，食少，神疲，乏力；脾陽(yáng)虛證模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：前述標(biāo)準(zhǔn)加畏寒、便溏。

1.4　模型評(píng)價(jià)方法　分別在 P1、P2，每組取 8 只大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4.1　代謝水平評(píng)價(jià)　上午 9~10 時(shí)測(cè)量其體質(zhì)量以評(píng)價(jià)消瘦；測(cè)肛溫以評(píng)估畏寒；單只放入代謝籠24 h 后計(jì)算進(jìn)食 / 水量，即投食 / 水量 - 剩余量，以評(píng)價(jià)食少；按文獻(xiàn) [12] 方法收集糞便，檢測(cè)大便含水率，即（大便濕重 - 大便干重）/ 大便濕重×100%，觀察便溏情況。

1.4.2　神疲評(píng)價(jià)　采用Supermaze動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），按文獻(xiàn) 方法進(jìn)行檢測(cè)，即將大鼠放入箱體中心，觀察 5 min 內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)，徹底清潔箱體后，檢測(cè)下一只大鼠。

1.4.3　乏力評(píng)價(jià)　采用 YLS-13A 大小鼠抓力測(cè)定儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）檢測(cè)前肢抓力。先用右手將大鼠按放在抓力板上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手輕輕松開(kāi)抓力板，待大鼠用力抓住抓力板時(shí)，及時(shí)加力后拉，以得到最大抓力。專人連續(xù)測(cè)量 3 次，取平均值。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，比較采用單因素方差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1  大鼠代謝水平  由表 1 可見(jiàn)，與對(duì)照組 P1 比較，模型組 P1 大鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量和進(jìn)水量均下降，該組大鼠出現(xiàn)消瘦和食少；與對(duì)照組 P2 比較，模型組 P2 的體質(zhì)量、肛溫、進(jìn)食量和進(jìn)水量均減少，該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、畏寒和食少，而大便含水率增加，該組大鼠出現(xiàn)便溏；與模型組 P1 比較，模型組 P2 的體質(zhì)量和肛溫均下降，但大便含水率升高。

2.2  大鼠神疲乏力情況  圖 1 和表 2 可見(jiàn)，對(duì)照組P1 和 P2 比較無(wú)明顯差異，大鼠活動(dòng)區(qū)域大，運(yùn)動(dòng)距離遠(yuǎn)，站立次數(shù)多，前肢抓力大；與對(duì)照組 P1比較，模型組 P1 和 P2 的活動(dòng)區(qū)域明顯變小，運(yùn)動(dòng)距離、站立次數(shù)和前肢抓力均明顯下降，提示兩組大鼠出現(xiàn)了神疲和乏力現(xiàn)象；與模型組 P1 比較，模型組 P2 的活動(dòng)區(qū)域更小，甚至沒(méi)有形成閉合運(yùn)動(dòng)軌跡，上述 3 個(gè)指標(biāo)均降低，表示該組大鼠的神疲和乏力更加嚴(yán)重。

3　討論

動(dòng)物模型是中醫(yī)證候研究的重要內(nèi)容，其復(fù)制過(guò)程應(yīng)符合中醫(yī)理論，不能單純進(jìn)行癥狀模擬，還應(yīng)考慮病因，甚至是模擬相關(guān)病機(jī)。通常認(rèn)為，脾陽(yáng)虛的發(fā)生多源于脾氣虛，也可因外寒直中、苦寒傷陽(yáng)和腎陽(yáng)不足。由于病因較多，本研究?jī)H選擇了脾氣虛和苦寒傷陽(yáng)兩個(gè)進(jìn)行模擬，即以脾氣虛大鼠為對(duì)象，通過(guò)灌服番瀉葉，達(dá)到損傷脾陽(yáng)的目的。而在復(fù)制脾氣虛模型時(shí)，首先考慮的仍然是病因病機(jī)。誘發(fā)脾氣虛的病因有飲食不節(jié)，勞倦過(guò)度，憂思日久，稟賦不足，素體虛弱，年老體衰，大病初愈，調(diào)養(yǎng)失慎等。還是由于病因較多，本研究選擇了較為常見(jiàn)的飲食不節(jié)和勞倦過(guò)度進(jìn)行模擬，即采用飽食 1 d，饑餓 2 d，結(jié)合每日力竭游泳，造成脾氣虛。因此，本實(shí)驗(yàn)在復(fù)制脾陽(yáng)虛模型的過(guò)程中，先后施加的因素有飲食失節(jié)、勞倦過(guò)度和苦寒傷陽(yáng)，分別模擬了脾氣虛和脾陽(yáng)虛證的部分病因病機(jī)，同時(shí)也限定了本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的脾氣虛為飲食不節(jié)和疲勞型，脾陽(yáng)虛為脾氣虛和苦寒傷陽(yáng)型。

由于模型復(fù)制為階段性，其評(píng)價(jià)也應(yīng)分階段進(jìn)行，從而有效質(zhì)控模型復(fù)制過(guò)程。本研究依據(jù)二證的臨床辨證要點(diǎn)，結(jié)合大鼠的生物學(xué)特征，建立了較為簡(jiǎn)便易行的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。首先根據(jù)脾氣虛的臨床辨證要點(diǎn)，即食少、腹脹、便溏及氣虛證等，建立大鼠脾氣虛的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：消瘦，食少，神疲，乏力；其次根據(jù)脾陽(yáng)虛的臨床辨證要點(diǎn)，即脾氣虛的癥狀加虛寒證，設(shè)立大鼠脾陽(yáng)虛證的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：消瘦，食少，神疲，乏力，畏寒，便溏。實(shí)際上，后一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為前一標(biāo)準(zhǔn)加上畏寒和便溏，即脾氣虛加寒象，這體現(xiàn)了模型評(píng)價(jià)的連續(xù)性。依此標(biāo)準(zhǔn)，本研究在造模的 P1 和 P2 進(jìn)行階段性評(píng)價(jià)。探索客觀簡(jiǎn)便的模型評(píng)價(jià)方法一直是中醫(yī)證候模型研究的重要內(nèi)容，其目的是減少主觀因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，提高模型復(fù)制的成功率，確保模型復(fù)制的穩(wěn)定性，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。針對(duì)上述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)建立了較為客觀和簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，以評(píng)估大鼠的類人癥狀。實(shí)際上，目前已經(jīng)能夠通過(guò)檢測(cè)大鼠的體質(zhì)量、肛溫、進(jìn)食 / 水量和大便含水率等，分別對(duì)消瘦、畏寒、食少和便溏等進(jìn)行量化評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組 P1 的體質(zhì)量、進(jìn)食 / 水量均低于對(duì)照組 P1，但肛溫和大便含水率無(wú)明顯變化，表明大鼠在接受 15 d 的飲食不節(jié)和力竭游泳刺激后，出現(xiàn)了消瘦和食少，但無(wú)畏寒和便溏現(xiàn)象；模型組 P2 的體質(zhì)量、進(jìn)食 / 水量、肛溫均

低于對(duì)照組 P2，且大便含水率顯著增加，說(shuō)明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、畏寒和便溏等類人癥狀。

與上述指標(biāo)不同，“神疲”和“乏力”屬于自述性疲勞癥狀，僅憑目測(cè)難以客觀判定大鼠的疲勞程度，特別是難以區(qū)分二者在脾氣虛和脾陽(yáng)虛中的差別。本課題組前期工作提出，“神疲”和“乏力”均屬于疲勞范疇，但前者主要是中樞性，后者則為外周性，可以分別采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)大鼠雙前肢抓力進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)觀察到，對(duì)照組 P1和 P2 大鼠進(jìn)入檢測(cè)箱后，更多地活動(dòng)于四周較暗區(qū)域，并有快速通過(guò)中心強(qiáng)光區(qū)域的現(xiàn)象，其運(yùn)動(dòng)距離遠(yuǎn)、站立次數(shù)多，顯示這些大鼠能夠準(zhǔn)確感知不同區(qū)域的光照強(qiáng)度，具有明顯的趨暗現(xiàn)象，并對(duì)新鮮環(huán)境表現(xiàn)出較強(qiáng)的探索能力，反映了大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于明顯興奮狀態(tài)。與此相比，模型組P1 和 P2 的活動(dòng)范圍小，運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)均顯著降低，提示大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮度程度較低，探索“意愿”較差，處于“神疲”狀態(tài)。在大鼠雙前肢抓力方面，結(jié)果顯示模型組 P1 和 P2 的前肢抓力分別低于對(duì)照組 P1 和 P2，提示大鼠出現(xiàn)“乏力”表現(xiàn)。

匯總上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，模型組 P1 的體質(zhì)量、進(jìn)食 / 水量、曠場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)距離和垂直活動(dòng)次數(shù)，以及前肢抓力等，均顯著低于對(duì)照組 P1，表明該組大鼠出現(xiàn)了消瘦、食少、神疲和乏力等類人癥狀，處于脾氣虛狀態(tài)。而模型組 P2 的上述指標(biāo)與肛溫均顯著低于對(duì)照組 P2，且大便含水率顯著增加，說(shuō)明該組大鼠除了產(chǎn)生脾氣虛的類人癥狀外，還有畏寒和便溏現(xiàn)象，已經(jīng)處于脾陽(yáng)虛狀態(tài)。此外，通過(guò)模型組 P1 和 P2 之間的比較，還可以發(fā)現(xiàn)脾陽(yáng)虛時(shí)大鼠的體質(zhì)量、肛溫、運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)明顯低于脾氣虛，大便含水率顯著高于脾氣虛，但兩者在進(jìn)食 / 水量方面沒(méi)有明顯差異，這些說(shuō)明從脾氣虛發(fā)展為脾陽(yáng)虛時(shí)，盡管大鼠的納少癥狀沒(méi)有進(jìn)一步加重，但大鼠更加消瘦，神疲和乏力更為嚴(yán)重，并出現(xiàn)了畏寒和便溏等較為明顯的寒象。

綜上所述，本研究所采用的階段式造模方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，能夠成功地復(fù)制大鼠的有限性脾陽(yáng)虛證模型，并且在消瘦、神疲、乏力、畏寒和便溏等方面與脾氣虛進(jìn)行有效區(qū)分。