動物細胞培養(yǎng)及外源基因?qū)氲脑砗筒僮鞑襟E
動物細胞培養(yǎng)及外源基因?qū)氲脑砗筒僮鞑襟E
實驗原理
細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點，一是研究對象是活的細胞，可長時期地監(jiān)控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質(zhì)均一的細胞，需要時還可采用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經(jīng)濟等優(yōu)點。
然而，細胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細胞脫離了機體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細胞，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細胞視為一種既保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。
由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細胞，以分析其表達，測定表達對細胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_的基因產(chǎn)物純化。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞有兩種途徑：穩(wěn)定（永久）或暫時性轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的是將轉(zhuǎn)移基因整合到細胞染色體DNA上，形成穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)移基因的細胞系。一般需要共轉(zhuǎn)染一個選擇標記，用于追蹤轉(zhuǎn)染成功的細胞或轉(zhuǎn)染效率。暫時性轉(zhuǎn)染的目的是為了分析轉(zhuǎn)移基因的暫時轉(zhuǎn)錄或表達，一般在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)進行。針對培養(yǎng)細胞的外源DNA導(dǎo)入已發(fā)展出多種技術(shù)，其中常用的有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暫時性轉(zhuǎn)染和永久性轉(zhuǎn)染。但它們有各自適用的細胞系。培養(yǎng)的細胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數(shù)量級的差異。因此針對細胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要。
Graham和Vander EB（1973）首次報告了用Ca3(PO4)2-DNA沉淀將腺病毒SV40導(dǎo)入哺乳動物細胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導(dǎo)入并在哺乳動物染色體上穩(wěn)定整合外源DNA。至今對于磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染的確切機理仍不清楚。一般認為轉(zhuǎn)移DNA通過內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，然后進入細胞核，而CaPO4處理被認為是產(chǎn)生了一種能促使DNA附著在細胞表面的環(huán)境。
細胞凋亡是細胞的一種基本生命現(xiàn)象，對于機體的組織發(fā)育、器官分化及多種病理過程均具有重要作用。細胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征。包括細胞膜皺縮，胞間連接減少，染色體凝集，細胞核崩解并形成凋亡小體等。其中一個強有力的生化指標是“DNA Ladder”的產(chǎn)生，由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細胞的總DNA可以在核小體間進行切割，提取總DNA進行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）。一般認為出現(xiàn)DNA Ladder 的細胞肯定發(fā)生了凋亡，但并非所有發(fā)生凋亡的細胞都會出現(xiàn)DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制，只有當?shù)蛲黾毎嫉郊毎偭康?5%以上時，特異降解的DNA經(jīng)過電泳才會較好地顯示DNA Ladder。
細胞凋亡的信號可能來自于細胞外部或細胞內(nèi)部。其中死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑（Death-receptor Pathway）是細胞外部信號（細胞因子）誘導(dǎo)凋亡的主要方式。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體家族，其共同特征是具有一個同源的死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD,）。當死亡受體的配體與之結(jié)合以后或死亡受體本身過量表達均可促使受體的死亡結(jié)構(gòu)域的寡集化，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC, death-inducing signaling complex），DISC通過其它一些接頭蛋白（adaptor protein），活化凋亡特異性蛋白酶Caspase-8，從而啟動凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生包括“DNA Ladder”在內(nèi)的一系列生理特征。死亡受體中較為典型的是CD95（Fas）和TNF-R1。在本實驗中，我們在293細胞中過量表達TNF-R1，誘導(dǎo)293細胞凋亡，觀察凋亡細胞的形態(tài)并檢測其“DNA Ladder”。
實驗試劑
1. 細胞營養(yǎng)液（DMEM液體培養(yǎng)基，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。
2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO4·2H2O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl2（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液，超純水（滅菌）。
3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，無水乙醇，酚/氯仿，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，EB。
實驗設(shè)備
1. 10cm細胞培養(yǎng)皿
2. 50ml、15ml一次性離心管
3. 10ml玻璃吸管（滅菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管
4. 二氧化碳培養(yǎng)箱
5. 倒置顯微鏡
6. 20μl，200μl微量移液器
7. 1.5ml離心管（滅菌）
8. 200μl微量移液器頭
9. 1ml微量移液器
10. 低速臺式離心機
11. 高速臺式離心機
12. 4°C，－20°C冰箱
13. DNA凝膠電泳設(shè)備
14. 紫外凝膠成像儀
實驗材料
胚腎細胞系293，TNF－R1哺乳動物細胞表達質(zhì)粒（CsCl超速離心純），哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）。
實驗步驟
1. 293細胞的傳代培養(yǎng)（第一天）
1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài)，確定傳代比例。
為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因此應(yīng)根據(jù)母細胞的生長密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。
2) 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動，將溶液倒出。
3) 消化與分裝。
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化完全，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。
在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天）
1) 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細胞的生長狀態(tài)
a. 觀察細胞是否污染
b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化
c. 觀察細胞的生長密度
2) 轉(zhuǎn)染
a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。
b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。
c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。
3. 凋亡細胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天）
1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態(tài)上的差異。
2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。
3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。
