血液谷胱甘肽過氧化物酶活性比色法定量檢測試劑盒使用說明書

血液谷胱甘肽過氧化物酶活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

血液谷胱甘肽過氧化物酶（GSH PX）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來測定血液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種血液樣品（動物、人體等）包括血漿和血清谷胱甘肽過氧化物酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase；GSH PX或GPX；EC 1.11.1.9）屬于硒蛋白（Selenoprotein）家屬成員之一，在細(xì)胞漿和線粒體組分中表達，其功能在于催化各種過氧化物的還原，包括氫過氧化物、過氧化氫等，保護細(xì)胞免受氧化損害。酶活的降低與巴金森氏、慢性腎小球腎炎（glomerulonephritis）等疾病有關(guān)。在哺乳動物中，存在四種類型的谷胱甘肽過氧化物酶：I型為經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)型；II型為胃腸道型；III型為血漿型；IV型為磷脂氫過氧化代謝型（phospholipid hydroperoxide metabolizing）。除IV型（為單體）外，谷胱甘肽過氧化物酶的結(jié)構(gòu)為同源四體，每個單體為22至23kd，其活性結(jié)構(gòu)域含有硒代半胱氨酸（selenocysteine）�；�于谷胱甘肽過氧化物酶催化有機過氧化物（ROOH）的還原，同時使還原型谷胱甘肽（reduced glutathione；GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione； GSSG）；進而在谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase；GR）的作用下，氧化型谷胱甘肽被還原成還原型谷胱甘肽，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），根據(jù)其氧化后峰值的降低（340nm 波長），來定量分析谷胱甘肽過氧化物酶的總活性。谷胱甘肽過氧化物酶偶聯(lián)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A）  毫升

底色液（Reagent B）  毫升

反應(yīng)液（Reagent C）    毫升

陰性液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存底色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent B）和反應(yīng)液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

選擇二：血清樣品

• 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲存管 
• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 測定準(zhǔn)備
• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent B）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度
• 背景對照測定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）
• 樣品測定
• 移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)） 

五、計算樣品活性

• 酶標(biāo)板測定
• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入xx微升底色液（Reagent B）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）
• 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent D）或待測樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標(biāo)板
• 即刻放進酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 檢測敏感范圍為5至30毫單位/毫升
• 待測樣本避免含有還原劑（DTT和巰基乙醇）以及某些去垢劑（TWEEN-20、TRITON X-100）等，干擾檢測
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)比色測定
• 背景空對照0秒讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)5分鐘
• 比色測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 谷胱甘肽過氧化物酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列細(xì)胞酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感