如何根據(jù)細(xì)胞種類的特性科學(xué)鋪板培養(yǎng)

細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中最常見又必須掌握的一門技術(shù)，看似簡單，我們卻經(jīng)常遇到：如細(xì)胞居中或者中間稀疏等不均勻分布的現(xiàn)象，導(dǎo)致我們只能扔掉，重新鋪板。既耽擱時間又浪費(fèi)了細(xì)胞及培養(yǎng)板等資源。歷經(jīng)多次失敗后，才發(fā)現(xiàn)原來細(xì)胞鋪板是有規(guī)律可循的，今天我們就聊一聊：細(xì)胞鋪板的技巧。

如下圖為：細(xì)胞鋪板時，常出現(xiàn)的細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象。

細(xì)胞居中和細(xì)胞邊緣化

首先，了解一下細(xì)胞鋪板的必要性！

從經(jīng)濟(jì)和高效的角度來說，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板。如在進(jìn)行藥物對待測細(xì)胞半抑制率（IC50）測試時，通常使用96孔板，一方面可以設(shè)置濃度梯度；另外還可一次性測多個藥物，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

如下表格：

常見的幾種培養(yǎng)板規(guī)格及其應(yīng)用

細(xì)胞鋪板主要分為3大步驟：收集細(xì)胞→細(xì)胞計(jì)數(shù)→細(xì)胞鋪板

一、收集細(xì)胞   

即把培養(yǎng)皿/瓶的細(xì)胞消化收集，與傳代一樣，不再贅述。

二、細(xì)胞計(jì)數(shù)

一般傳代的細(xì)胞密度較大，在鋪板時最好控制細(xì)胞數(shù)量。一般采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，對于體積較大的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞采用下圖藍(lán)色部分的白細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域，即利用四個角的四個大方格。

血球計(jì)數(shù)板模式圖（圖片來自百度）

計(jì)算原理：由于每個大方格子（紅框），邊長為1mm，蓋上蓋玻片后的高度為0.1mm，因此計(jì)數(shù)室內(nèi)加滿細(xì)胞懸液的體積為0.1mm³=10^-4cm³=10^-4ml。

細(xì)胞數(shù)量 = 4個大格子的平均數(shù)*稀釋倍數(shù)*10⁴個/mL

常見問題解答：

Q：細(xì)胞計(jì)數(shù)前后出現(xiàn)較大誤差？

• 考慮細(xì)胞沉降導(dǎo)致懸液不勻；懸液體積過大或過��；稀釋倍數(shù)太高或太低等原因造成。

Q：如何克服細(xì)胞懸液不均勻的問題？

• 盡量將細(xì)胞吹打?yàn)閱蝹�，防止抱團(tuán)，且用移液槍充分吹打，使其均勻懸浮在培養(yǎng)基中。

Q： 一般加多少細(xì)胞懸液合適？

• 由于加入計(jì)數(shù)室的量，過少會導(dǎo)致計(jì)數(shù)室內(nèi)出現(xiàn)氣泡，過多則會使得計(jì)數(shù)板上的蓋玻片不緊貼計(jì)數(shù)板，使得高度變高，體積變大；計(jì)數(shù)室體積為9mm³，所以一般加15ul左右。

Q： 計(jì)數(shù)時，細(xì)胞稀釋倍數(shù)如何控制？

• 若是計(jì)數(shù)室細(xì)胞過稀或過密，會造成較大誤差，一般最適濃度為5～10×10⁵細(xì)胞/ml。如一般10cm皿的細(xì)胞約300-500萬個，一些細(xì)胞個體小也能達(dá)到1000-2000萬，可根據(jù)所需細(xì)胞數(shù)目取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。舉例來說可將100ul細(xì)胞懸液加入到900ul培養(yǎng)基中，混勻后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)所得乘以10即為實(shí)際細(xì)胞密度。

Q： 計(jì)數(shù)的原則有哪些？

• 計(jì)數(shù)時對壓在最外圈邊線的細(xì)胞遵循“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，遇到兩個以上的細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)計(jì)為一個細(xì)胞。

三、細(xì)胞接種

根據(jù)操作手法，一般分為2類：

第一類：6孔板、12孔板和24孔板

各種培養(yǎng)板規(guī)格（來自Thermo Fisher）

操作步驟：

① 稀釋細(xì)胞：根據(jù)上述計(jì)數(shù)結(jié)果后，將細(xì)胞稀釋到目的濃度；

② 加入細(xì)胞懸液：充分混勻后，貼壁加入細(xì)胞懸液；

③ 搖勻：這一步很重要！接種結(jié)束后，將板在超凈臺上十字形搖勻，最后于顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)：

• 鋪板后，不可以轉(zhuǎn)圈搖，因?yàn)榧?xì)胞會被帶到中間；

• 如果培養(yǎng)液量少，由于瓶體內(nèi)液體有向邊緣吸的特性，所以造成中間低洼，細(xì)胞容易聚集�？梢远嗉狱c(diǎn)液體緩解，若6孔板一般加2ml，我們可以加到2.5ml。

第二類：96孔板/384孔板

96孔板/384孔鋪板時步驟與上述基本一致，只是多使用排槍，即不用搖勻。

96孔板/384孔板（來自Thermo Fisher）

注意事項(xiàng)：

• 用排槍吸取時，一定要保證每個槍頭吸上來的懸液體積一致；

• 鋪96孔板時，如果是用于進(jìn)行MTS等長時間測試時，最外圈應(yīng)空余出來，不接細(xì)胞，加入一圈PBS或多于細(xì)胞懸液，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應(yīng)；

• 96孔板或384孔板鋪好細(xì)胞后最好不再搖晃，小心地放入培養(yǎng)箱即可。

常見問題解答：

Q： 如何避免每個孔之間的細(xì)胞不均勻？

• 鋪板速度盡量快點(diǎn)，在加完半邊板后，需要再次將培養(yǎng)皿內(nèi)剩余的細(xì)胞懸液充分混勻再繼續(xù)鋪板。

Q：十字形搖勻具體是怎么搖？

• 放在水平板面上先上下移動，再左右移動，每個方向5到6次。

Q：對于某些容易聚團(tuán)的細(xì)胞，該怎么辦？

• 對于容易聚團(tuán)的細(xì)胞，盡管當(dāng)時搖勻了，但是靜置30min后，取出后將細(xì)胞培養(yǎng)板后，肉眼即可見嚴(yán)重的細(xì)胞居中抱團(tuán)現(xiàn)象，比如乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。對于這種細(xì)胞解決辦法：從個人經(jīng)驗(yàn)來看，若是時間允許的話，可以降低接種密度，可以隔一天細(xì)胞多了再進(jìn)行藥物處理或者劃線等。

Q：為啥要貼側(cè)壁加入細(xì)胞懸浮液？

• 一般從孔的左邊靠近底部貼壁加入，不要從中間加入；因?yàn)榻臃N之前已將細(xì)胞懸液做過充分混勻，直接從側(cè)壁加入能盡量保持細(xì)胞懸液的均勻狀態(tài)；另外貼側(cè)壁加入也能減少孔內(nèi)氣泡的產(chǎn)生。

Q：如何把握細(xì)胞密度？

• 細(xì)胞密度對于鋪板很重要，過密很容易造成細(xì)胞居中，過稀會造成細(xì)胞難以生長起來。一般進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們通常會設(shè)計(jì)一組不同細(xì)胞密度對報告基因度值影響的預(yù)實(shí)驗(yàn)，從而根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定細(xì)胞的具體接種數(shù)量。

Q： 有些貼壁不牢的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板中收取上清或移除上清時應(yīng)注意什么？

• 有些細(xì)胞如293T細(xì)胞貼壁不牢，如果需要在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，如果需要吸除上清，應(yīng)避免直接使用吸泵等吸力過大的設(shè)備，另外可以在收板時使用培養(yǎng)板專用離心機(jī)離心后在取出上清。另外也可以在接板前使用千分之一的明膠提前加入培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱孵育30分鐘以上后再將細(xì)胞接入。

細(xì)胞鋪板是個熟能生巧的實(shí)驗(yàn)，本期我們是根據(jù)多年實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)介紹的技巧，供大家參考，但鑒于每個人手法不同，培養(yǎng)的細(xì)胞特性也因人而異，因此，還需要實(shí)踐中多多練習(xí)，了解你手中細(xì)胞的特性，進(jìn)而擁有一套屬于你的操作手法。如果你的實(shí)驗(yàn)中有更好的方法，也歡迎大家積極討論，互相學(xué)習(xí)！