AAT最亮的鈣離子熒光探針Calbryte的多種運用

百螢推薦：AAT最亮的鈣離子熒光探針Calbryte系列產(chǎn)品

AAT Bioquest研發(fā)生產(chǎn)的最亮的鈣離子熒光探針Calbryte系列產(chǎn)品（代表產(chǎn)品：Calbryte 520、Calbryte 590 、 Calbryte 630）。Calbryte 系列是開發(fā)用于檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光染料家族。這些指示劑的主要區(qū)別在于它們的激發(fā)和發(fā)射波長，它們均可以使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光儀器進(jìn)行檢測。Calbryte 系列已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀，它們還可以用于高通量篩選應(yīng)用。感興趣的朋友一起來看看吧！

---

Calbryte 系列染料與常見的Fluo-3和Fluo-4染料相比具有幾個關(guān)鍵優(yōu)勢 。Calbryte 系列染料能產(chǎn)生更亮的信號，具有更優(yōu)秀的信噪比，并大大增強(qiáng)了細(xì)胞保留能力。這些特點使Calbryte 系列染料成為傳統(tǒng)的鈣指示劑的絕佳替代品。
 

圖1.在Fluo-4，AM（左）和Calbryte 520AM（右）的CHO-K1細(xì)胞中測量ATP反應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以50,000個細(xì)胞/ 100 µL /孔在黑色96孔板中接種過夜。加入含丙磺舒的HH緩沖液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte 520 AM或含丙磺舒的HH緩沖液中的10 µg / ml Fluo-4，AM，并在37°C下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替換。加入ATP（50 µL /孔）以達(dá)到最終指示的10 µM濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。

 

Calbryte系列產(chǎn)品的命名

Calbryte 系列的染料是根據(jù)其最大發(fā)射波長命名的。例如，Calbryte 520在可見光譜的綠色區(qū)域發(fā)出熒光，而Calbryte 590和Calbryte 630在紅色和深紅色區(qū)域發(fā)出熒光。它們共有AM酯形式、鹽形式（以鉀鹽形式）。AM酯形式是可滲透細(xì)胞的形式，可用于檢測活細(xì)胞中的鈣離子。鹽形式主要用于校準(zhǔn)鈣指示劑。根據(jù)熒光信號強(qiáng)度計算細(xì)胞內(nèi)鈣濃度時，通常需要執(zhí)行此步驟。鹽形式的Calbryte 也可以用于向活細(xì)胞和組織中進(jìn)行顯微注射。

 

Calbryte系列產(chǎn)品在活細(xì)胞中的作用機(jī)制

當(dāng)測定活細(xì)胞中的鈣離子時，合成具有幾個乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能團(tuán)的Calbryte 染料。這樣做的原因有兩個。首先，AM酯是親脂性基團(tuán)，當(dāng)連接到Calbryte 核心結(jié)構(gòu)時，會形成整體上更疏水的化合物。這種增加的疏水性使Calbryte AM酯易于滲透完整的脂質(zhì)膜并滲透到活細(xì)胞中。這消除了對電穿孔、顯微注射或其他類似破壞性加載技術(shù)的需求；其次，Calbryte 染料雖然呈AM酯形式，但基本上是非熒光性且不可活化的。它們對存在于細(xì)胞外溶液中的微量Ca²⁺表現(xiàn)出最小的響應(yīng)。只有當(dāng)Calbryte 探針滲透到細(xì)胞中，并且只有在細(xì)胞內(nèi)酯酶切割掉AM酯官能團(tuán)之后，Calbryte 染料才被激活并對鈣離子有反應(yīng)。這兩步激活過程非常重要，因為它極大地減少了非特異性背景熒光。并且通過擴(kuò)展，它明顯增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號；最后，一旦激活了Calbryte 探針，它就會通過典型的螯合過程檢測細(xì)胞中鈣的鈣離子。但是，與其他螯合劑（例如Fluo-3和Fluo-4）不同，Calbryte 染料在與鈣結(jié)合時會表現(xiàn)出更大的響應(yīng)。在實驗中，Calbryte 探針在螯合后會表現(xiàn)出大于300倍的熒光增加。相比之下，F(xiàn)luo-4僅表現(xiàn)出100倍的增長。熒光響應(yīng)的這種明顯改善，使這種新型鈣離子檢測探針Calbryte對鈣的檢測極為穩(wěn)定，這是過去的鈣指示劑無法實現(xiàn)的。

 

Calbryte系列產(chǎn)品的優(yōu)勢

在活細(xì)胞實驗中，Calbryte 染料的信噪比比其他染料（例如Fluo-4）大一個數(shù)量級，在實驗研究中，這是一個巨大的優(yōu)勢，因為較差的信噪比對數(shù)據(jù)分析來說是非常頭疼的問題。它將結(jié)果與其他信號混在一起，可能會遺失掉許多重要數(shù)據(jù)，并導(dǎo)致巨大的測定差異。因此，在選擇試劑時，大多數(shù)研究人員更喜歡信噪比高的試劑。

信噪比不佳可能是由多種因素造成的，這些因素主要分為兩類。第一類，存在導(dǎo)致信號強(qiáng)度差的因素。這些可以包括：

1. 低消光系數(shù)和量子產(chǎn)率
2. 與目標(biāo)結(jié)合不佳
3. 遠(yuǎn)離激發(fā)光源的最大吸光度（_λmax）

Catbryte 系列染料的開發(fā)，完美的解決了以上問題。例如，Calbryte 520的量子產(chǎn)率是Fluo-3和Fluo-4的三倍。這意味著Calbryte 520吸收的每個光子從根本上比Fluo-3或Fluo-4發(fā)出更多的熒光，從而產(chǎn)生更亮的熒光信號。此外，所有Calbryte 系列染料的設(shè)計均應(yīng)使其最大吸收率發(fā)生在標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)源附近。例如，Calbryte 520（_λmax  = 492 nm）被常見的488 nm氬離子激發(fā)光線激發(fā)。

許多探針表現(xiàn)出較差的信噪比的第二個原因是由于高背景。高背景可能是由于以下原因造成的：

1. 細(xì)胞不滲透
2. 高自發(fā)熒光
3. 非特異性激活/結(jié)合
4. 細(xì)胞內(nèi)保留性差

這些因素中的許多與探針進(jìn)入細(xì)胞并有效定位于細(xì)胞質(zhì)的能力有關(guān)�？v觀過去的許多鈣指示劑，它們經(jīng)常遇到兩個問題：1.探針要么是相當(dāng)水溶性的，但太親水而不能滲透活細(xì)胞，要么是疏水性足夠滲透活細(xì)胞，但水溶性太差，在加載過程中會從溶液中沉淀出來，這兩種情況都不可取。Calbryte 系列熒光染料通過控制水溶性官能團(tuán)和前面提到的AM酯基來解決這個問題，通過優(yōu)化，Calbryte 染料能夠獲得更高的信噪比。

圖3.CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對ATP的反應(yīng)。將CHO-K細(xì)胞以每100 µL 40,000個細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過夜。將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 520 AM（左），Calbryte 590 AM（中）或Calbryte 630 AM（右）加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育1小時。將染料加載介質(zhì)替換為200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP處理，并使用FITC通道（Calbryte 520），TRITC通道（Calbryte 590）或Texas Red通道Calbryte 630），用熒光顯微鏡成像（Keyence）。

---

相關(guān)產(chǎn)品推薦

貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
20650	Calbryte 520 AM	2x50ug
20651	Calbryte 520 AM	10x50ug
20653	Calbryte 520 AM	1mg
20656	Calbryte 520，鉀鹽	2x50ug
20658	Calbryte 520，鉀鹽	10x50ug
20700	Calbryte 590 AM	2x50ug
20701	Calbryte 590 AM	10x50ug
20702	Calbryte 590 AM	1mg
20706	Calbryte 590，鉀鹽	5x50ug
20720	Calbryte 630 AM	2x50ug
20721	Calbryte 630 AM	10x50ug
20722	Calbryte 630 AM	1mg
20727	Calbryte 630，鉀鹽	5x50ug
36317	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	1Plates
36318	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	10Plates
36319	Screen Quest Calbryte 520 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	100Plates
36200	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	1Plates
36201	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	10Plates
36202	Screen Quest Calbryte 590 免丙磺舒和免洗鈣檢測試劑盒	100Plates
20050	細(xì)胞培養(yǎng)檢測 Pluronic F-127	10g
20052	細(xì)胞培養(yǎng)檢測 Pluronic F-127 20% DMSO溶液	10ml
20053	細(xì)胞培養(yǎng)檢測 Pluronic F-127 10%水溶液	10ml
20060	丙磺舒 細(xì)胞培養(yǎng)檢測	10x72mg
20061	丙磺舒 ReadiUse 鈉鹽 水溶性	10x77mg
20062	丙磺舒 ReadiUse 25 mM穩(wěn)定的水溶液	10x10ml
36312	Cell Meter 鈣檢測免洗和免丙磺舒檢測試劑盒*適用于酶標(biāo)儀*	100Tests

---

百螢生物是美國AAT Bioquest中國區(qū)域代理商，為您提供AAT Bioquest最優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、最詳盡的技術(shù)和最前沿的資訊，歡迎來電咨詢！