常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫染色 (IHCICCIF) 全流程解析

IHC/ICC/IF 總迷糊? 免疫染色為啥感覺(jué)那么多？
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Section.01
免疫染色知多少?

免疫染色 (Immunostaining) 是一項(xiàng)重要的生物學(xué)技術(shù)，主要用于檢測(cè)組織切片中的特定抗原并獲取有關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的信息。

免疫染色是基于抗體與其靶抗原的特異性結(jié)合 (圖 1)�？乖�抗體復(fù)合物的檢測(cè)依賴于與抗體偶聯(lián)的標(biāo)記物。使用酶時(shí)，需要酶的比色法或化學(xué)發(fā)光法底物。酶催化反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，可使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)。對(duì)于熒光染料，可使用熒光顯微鏡測(cè)量熒光信號(hào)，無(wú)需額外的底物^[1]。

圖 1. 免疫染色的典型工作流程。
免疫染色始于細(xì)胞或組織制備，其中特定細(xì)胞或組織樣本被固定以保留其結(jié)構(gòu)。然后將樣本與封閉緩沖液孵育，以防止抗原和抗體之間的非特異性結(jié)合。隨后，將樣本與特異性結(jié)合目標(biāo)抗原的一抗孵育，再與連接熒光染料或酶的二抗孵育。清洗去除多余抗體后，使用封固劑將樣本封固在載玻片上。最后，使用合適的顯微鏡觀察抗原-抗體復(fù)合物。


免疫染色：直接法 or 間接法?

免疫染色主要使用兩種方法：間接免疫染色法和直接免疫染色法。

• 間接法：同時(shí)使用一抗和二抗。一抗可特異性結(jié)合目標(biāo)抗原。一抗通常在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)注射特定抗原而產(chǎn)生 (例如山羊、小鼠或兔子)。二抗通常與可檢測(cè)標(biāo)記物（例如酶或熒光染料）偶聯(lián)，并與一抗結(jié)合。為防止交叉反應(yīng)，最好使用與產(chǎn)生一抗的物種不同的二抗。多個(gè)二抗可以與每個(gè)一抗相互作用，從而增強(qiáng)可檢測(cè)信號(hào)。此外，一種二抗可以與多種一抗一起使用。
• 直接法：使用與特異性結(jié)合抗原的可檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)的單一抗體。該方法只需一步抗體孵育，比間接法更簡(jiǎn)單、更快捷。然而，由于直接法使用單一抗體，其靈敏度低于間接法，而且由于可用的探針/酶偶聯(lián)一抗有限，其應(yīng)用受到限制。

圖 2. 直接法和間接法示意圖。

兩種方法各有優(yōu)勢(shì)，研究人員可參考下面表格 (表 1)^[1]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的方法！
 
表 1. 直接和間接免疫染色方法的特點(diǎn)

免疫染色：ICC、IHC 與 IF?

ICC 與 IHC 均屬于免疫染色。免疫組化 (Immunohistochemistry, IHC) 是用于檢測(cè)組織切片中特定抗原或蛋白質(zhì)，廣泛應(yīng)用于病理學(xué)，以診斷癌癥等疾病和研究組織特異性蛋白質(zhì)測(cè)定。當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)制備時(shí)，通常稱為免疫細(xì)胞化學(xué) (Immunocytochemistry, ICC)，其適用于多種細(xì)胞學(xué)樣本，例如細(xì)胞塊、風(fēng)干玻片、乙醇固定玻片、直接涂片、細(xì)胞離心涂片和液基細(xì)胞學(xué) (Liquid-based cytology, LBC) 樣本^[2][3]。ICC 常用于識(shí)別細(xì)胞中特定生物標(biāo)志物的存在、亞細(xì)胞定位和原位大分子相互作用^[1]。

免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 也是利用抗體和抗原的結(jié)合特異性，是免疫染色的一種廣泛應(yīng)用的例子。IHC 通常使用多種不同的酶標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)目標(biāo)抗原。(當(dāng)然，IHC 也可升級(jí)為多重?zé)晒馊旧��?mIHC)。ICC 通過(guò)使用與抗體偶聯(lián)的熒光染料或酶，可以分別在熒光顯微鏡和光學(xué)顯微鏡下可視化目標(biāo)抗原。IF 利用熒光顯微鏡檢測(cè)與抗體結(jié)合的熒光染料，此外，IF 可進(jìn)行多種熒光染色，允許研究人員進(jìn)行多重標(biāo)記，IF 的多重染色常用于評(píng)估大分子的共定位^[1]。
注意：對(duì)于多重染色，需要選擇發(fā)射光譜不重疊的熒光染料，以防止光譜重疊導(dǎo)致信號(hào)錯(cuò)誤解讀。
 
表 2. 不同類型免疫染色的特點(diǎn)^[1]
 
Section.02
ICC/IF: 實(shí)操流程

往期我們?yōu)榇蠹医榻B了免疫組化，本期我們來(lái)了解下 ICC/IF 究竟如何做？
 
第一步：樣品準(zhǔn)備
 
細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是一種基于抗體與標(biāo)記物相互作用的技術(shù)。它通過(guò)特異性的抗體與細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，再通過(guò)標(biāo)記物在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)流程通常包括樣品制備、固定、通透、封閉、抗體孵育、復(fù)染、封片和觀察 8 個(gè)部分。
 

圖 3. ICC/IF 實(shí)驗(yàn)流程圖。

目的

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)備狀態(tài)良好的細(xì)胞樣品。細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，細(xì)胞狀態(tài)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

步驟

基本步驟：
1. 準(zhǔn)備蓋玻片或共聚焦小皿。蓋玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，蓋玻片完全干燥后移至細(xì)胞培養(yǎng)板中，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。
2. 鋪細(xì)胞。在包被的蓋玻片或板上鋪適當(dāng)?shù)募?xì)胞，使后續(xù)固定細(xì)胞時(shí)，融匯度達(dá)到 50-60%。如果細(xì)胞過(guò)密或過(guò)稀，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能會(huì)受到影響。
3. 收集樣品。針對(duì)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，細(xì)胞牢牢貼壁后，收集樣品進(jìn)行后續(xù)操作。而對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以通過(guò)甩片進(jìn)行。
 
Tips:
① 盡量選用新鮮制備的樣本，并確定樣品中抗原分子的表達(dá)豐度；
② 后續(xù)所有操作，動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞脫落；
③ 后續(xù)所有操作都需避免干片。

第二步：固定

目的

使用固定劑（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)變性凝固，從而固定細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。同時(shí)，固定劑還能減少或終止內(nèi)源性或外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶的反應(yīng)，防止組織細(xì)胞自溶，保護(hù)抗原性。

固定劑如何選？
 
 
步驟
1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定細(xì)胞 10 ~ 15 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留的固定液。
 
Tips:
① 初次實(shí)驗(yàn)，建議從 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 開(kāi)始嘗試，倘若沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果，再調(diào)整固定時(shí)間或更換另一種固定劑。
② 較長(zhǎng)的孵育時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致更高的固定程度，直至表位可能過(guò)度固定。孵育時(shí)間短可能導(dǎo)致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時(shí)間需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

第三步：通透

目的

通過(guò)去污劑部分溶解細(xì)胞膜，形成孔洞，從而使抗體能夠到達(dá)細(xì)胞內(nèi)表位，與細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合。（該步驟可選做；通透步驟會(huì)破壞細(xì)胞膜，細(xì)胞膜表面抗原不適合選擇通透實(shí)驗(yàn)）
 
圖 4. 細(xì)胞膜打孔處理示意圖。

通透劑如何選？
 
 
步驟
 
1. 通透：加入 0.1–0.25% Triton X-100 (PBS 配制)，覆蓋細(xì)胞，室溫下通透 5-10 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留通透液。
 
Tips:
① 通透劑的濃度和孵育時(shí)間應(yīng)針對(duì)所用樣品進(jìn)行優(yōu)化。

第四步：封閉
 
封閉液中的成分能夠與細(xì)胞表面的非特異性位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止抗體與這些位點(diǎn)的非特異性結(jié)合。

目的

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)備狀態(tài)良好的細(xì)胞樣品。細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，細(xì)胞狀態(tài)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

封閉液的選擇
 
可以選擇與二抗相同來(lái)源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗為山羊抗小鼠，應(yīng)選擇山羊血清作為封閉劑。

步驟

使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室溫或 37℃ 封閉 1 h。

Tips:
① 封閉溶液不應(yīng)含有一抗的宿主動(dòng)物血清，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致高背景。

第五步：抗體孵育

目的

使抗體充分與目的蛋白抗原結(jié)合，決定了熒光信號(hào)的位置和特異性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

注意：該步驟可選擇 (i) 直接檢測(cè)，一抗直接與熒光基團(tuán)偶聯(lián)。(ii) 間接檢測(cè)，使用合適的熒光標(biāo)記二抗檢測(cè)一抗。這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，其中，間接檢測(cè)是最常用的檢測(cè)方法。
 
抗體的選擇

• 單染：一抗要選擇任一宿主來(lái)源的抗體，二抗選擇對(duì)應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。例如，一抗是小鼠來(lái)源，二抗要選擇抗小鼠的抗體 (如山羊抗小鼠，驢抗小鼠等)。
• 雙染/多染：在進(jìn)行多個(gè)熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，一抗要選擇不同宿主來(lái)源的抗體，二抗選擇對(duì)應(yīng)的抗一抗宿主的抗體。同時(shí)要注意選擇具有高區(qū)分度的熒光二抗，避免熒光重疊。例如，在進(jìn)行三色熒光標(biāo)記時(shí)，一般選用綠色、藍(lán)色和紅色這三種熒光基團(tuán)，以確保每個(gè)信號(hào)都能被清晰地區(qū)分出來(lái)。

步驟

基本步驟：
(以間接檢測(cè)為例)：
1. 一抗孵育：根據(jù)研目標(biāo)抗原和樣品特性選擇符合要求的一抗，并按照說(shuō)明書(shū)要求稀釋一抗，加入到樣品中并在 4℃ 條件下孵育過(guò)夜 (12 ~ 16 h)。
2. 洗滌：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整。
3. 二抗孵育：根據(jù)一抗的種類及樣品特性 (二抗攜帶的熒光需要與樣品自帶熒光不沖突) 選擇合適的熒光標(biāo)記的二抗，在室溫下避光孵育 1 h。稀釋和使用方法應(yīng)遵循說(shuō)明書(shū)。
4. 洗滌：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未結(jié)合的抗體。洗滌次數(shù)和時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整。

Tips:
① 孵育熒光二抗之后，一定要注意避光保存！
② 確定合適的二抗工作濃度濃度，避免無(wú)信號(hào)或背景過(guò)高現(xiàn)象的發(fā)生；
③ 注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；
④ 洗滌時(shí)轉(zhuǎn)速要溫和，防止細(xì)胞脫片。

第六步：復(fù)染

目的

使用染色劑對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，直觀地區(qū)分細(xì)胞核和其他細(xì)胞及抗原結(jié)構(gòu)的位置，便于觀察和解讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

步驟

在清洗完畢的細(xì)胞中滴加 DAPI，室溫避光靜置約 30 s。

第七步：封片

目的

保護(hù)已經(jīng)染色的樣本，防止其受到外界環(huán)境的損害。同時(shí)，封片還有助于保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，便于后續(xù)的分析和比較。

步驟

1. 封片：向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細(xì)胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。
2. 觀察：輕輕用指甲油密封蓋玻片四周，避免樣品在顯微鏡下移動(dòng)。指甲油干透后，直接觀察或 4℃ 下避光保存。

Tips:
① 避免氣泡：在封片過(guò)程中，需要避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)干擾顯微鏡下的觀察，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在滴加封片液時(shí)，需要緩慢而均勻地滴加，并用鑷子輕輕調(diào)整蓋玻片的位置，以確保沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。
② 選擇合適的封片劑：封片劑的選擇也很重要。常用的封片劑包括緩沖甘油、抗熒光淬滅封片液等。在選擇封片劑時(shí)，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求和標(biāo)本的特性進(jìn)行選擇。
③ 保持避光和濕度：封片后，需要將標(biāo)本放置在避光和濕度適宜的環(huán)境中保存。這可以有效地防止熒光信號(hào)的淬滅和標(biāo)本的干燥，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
④ 細(xì)胞樣品在封片劑處理后，理論上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，為了成像清晰和高熒光強(qiáng)度，建議盡快進(jìn)行成像分析。

第八步：觀察

成像及分析：在顯微鏡下觀察并采集圖像，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

讓我們?cè)賮?lái)看看科研人的期刊文獻(xiàn)中的免疫熒光 (IF) 成果圖吧！

               
圖 5. 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)免疫熒光圖^[1]。
 
當(dāng)然，如果你沒(méi)有使用與抗體偶聯(lián)的熒光染料，那么你的圖片是這樣的！
 
圖 6. 腫瘤標(biāo)志物 P63 的 ICC 檢測(cè)。

在 LBC 玻片上進(jìn)行 p63 染色�？梢�(jiàn)核染色，突出肌上皮細(xì)胞�？梢钥吹� (a) 中一片較大的細(xì)胞，(b) 中一小簇細(xì)胞。兩者均顯示中度細(xì)胞異形性，且染色細(xì)胞數(shù)不足 25%。如果這是標(biāo)本的主要形態(tài)，則足以支持惡性腫瘤的診斷。

好啦，朋友們，到這里細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)就結(jié)束啦！怎么樣？有沒(méi)有躍躍欲試的小念頭？如有購(gòu)買需求或?qū)嶒?yàn)疑惑都可 Call 小 M 喔~
 

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[1] Park G, et al. Brief guide to immunostaining. Mol Cells. 2025 Jan;48(1):100157. doi: 10.1016/j.mocell.2024.100157. Epub 2024 Nov 19.
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