小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒使用說明

小鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的Adiponectin的ELISA試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為36.5pg/ml，與人TNF-α、TWEAK等均沒有交叉反應(yīng)，與大鼠Adiponectin有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
脂聯(lián)素(Adiponectin)，又稱Acrp30 (Adipocyte Complement-Related Protein)，adipoQ、apM1 (Adipose Most 
Abundant Gene Transcript 1)或GBP28 (Gelatin-Binding Protein)，是一種分子量30kDa的糖蛋白，主要由脂肪細胞分泌，參與調(diào)控代謝和炎癥過程。成熟的小鼠脂聯(lián)素含有N端的膠原蛋白區(qū)域(66個氨基酸)和C端的C1q/TNF-α樣球狀區(qū)域(137個氨基酸)，與人和大鼠脂聯(lián)素分別具有83%和91%的氨基酸同源性。
脂聯(lián)素以90kDa的同源三聚體形式存在，其中兩個亞基以二硫鍵連接，第三個亞基以非共價鍵連接。兩個三聚體能夠通過共價鍵相連形成180kDa的六聚體復(fù)合物，六聚體又能形成分子量超過300kDa的HMW (High Molecular Weight)脂聯(lián)素。血漿中，不同脂聯(lián)素變體之間穩(wěn)定存在，不能發(fā)生互換。不同變體含量比例的高低具有明顯的生物學(xué)意義，在女性體內(nèi)，HMW脂聯(lián)素的濃度遠高于男性，三聚體和六聚體的脂聯(lián)素濃度在男女之間也有差別。血漿中脂聯(lián)素水平通常占總體血漿蛋白的0.01%左右。脂聯(lián)素通過與7次跨膜受體Adipo R1和Adipo R2作用發(fā)揮生物學(xué)活性，Adipo R1表達廣泛，與脂聯(lián)素的剪切形式gAdiponectin具有更高的親和力；Adipo R2則主要表達在肝臟上，與兩種形式的脂聯(lián)素親和力基本相同。不同形式的脂聯(lián)素同樣還能與肌肉中的鈣黏蛋白13和一些生長因子相互作用。
脂聯(lián)素通過調(diào)控葡萄糖和脂肪酸代謝增強胰島素敏感性，它能夠減少血漿中葡萄糖和甘油三酯濃度，升高胰高血糖素，但并不改變胰島素濃度。在肝臟中，脂聯(lián)素能夠增強胰島素對糖異生的抑制作用。在骨骼肌中，脂聯(lián)素能夠促進脂肪酸吸收并氧化，促進葡萄糖吸收和乳酸鹽產(chǎn)生。脂聯(lián)素的不同變體能夠特異性的激活肝臟和肌肉中的AMPK和NFκB通路。在成人體內(nèi)，總脂聯(lián)素水平與代謝綜合征成負相關(guān)，HMW脂聯(lián)素水平的減少與肥胖、胰島素抵抗、脂肪酸氧化減少、血脂異常、冠狀動脈疾病和動脈粥樣硬化形成相關(guān)。在接受胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物治療時，血漿中HMW脂聯(lián)素水平會出現(xiàn)升高。
脂聯(lián)素與受體結(jié)合后可以通過激活LKB1、CaMKKβ或SIRT1參與調(diào)控AMPK的活化，活化的AMPK可以使胰島素受體底物的酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的胰島素受體底物募集并激活PI3K/AKT通路。
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中小鼠Adiponectin的濃度，其原理見圖1。小鼠Adiponectin特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時，其中的小鼠Adiponectin會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗小鼠Adiponectin抗體后，生物素化抗小鼠Adiponectin抗體與小鼠Adiponectin結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。小鼠Adiponectin濃度與A450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中小鼠Adiponectin濃度。

圖1. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進行96次檢測。
包裝清單：

保存條件：
標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效；試劑盒其它組分4℃保存6個月內(nèi)有效。除標(biāo)準(zhǔn)品外，試劑盒其它組分嚴(yán)禁凍存。
注意事項：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
TMB溶液請勿接觸氧化劑和金屬，否則容易失效。
加樣時，請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
由于本試劑盒均經(jīng)過獨立測試，所以請勿混用不同貨號和不同批次的試劑盒組分，即使是同種試劑盒不同批次的試劑盒組分也不能混用。多個試劑盒同時檢測時，請獨立使用各個試劑盒中的試劑，請勿使用不同試劑盒中相同名稱的組分。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。