siRNA轉(zhuǎn)染使用說(shuō)明

使用說(shuō)明：
1. siRNA轉(zhuǎn)染：
a. 細(xì)胞培養(yǎng)(以六孔板為例，其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿可參考六孔板)：在轉(zhuǎn)染前一天(18-24小時(shí))按照每孔約20-70萬(wàn)細(xì)胞(具體的細(xì)胞數(shù)量據(jù)細(xì)胞類型、大小和細(xì)胞生長(zhǎng)速度等而定)接種到六孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，使第二天細(xì)胞密度能達(dá)到約70-80%。
b. 在進(jìn)行下述轉(zhuǎn)染步驟前，把培養(yǎng)有細(xì)胞的六孔板每孔換成2ml新鮮培養(yǎng)液(含有血清和抗生素的完全培養(yǎng)液)。對(duì)于LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑，抗生素的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，也不會(huì)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
c. 參考下表，取一個(gè)潔凈無(wú)菌離心管，對(duì)于待轉(zhuǎn)染的六孔板中每一個(gè)孔的細(xì)胞，加入125µl不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM^® Medium，加入100pmol siRNA，并用槍輕輕吹打混勻；再加入4µl LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑，用槍輕輕吹打混勻，請(qǐng)?zhí)貏e注意不可vortex或離心。配制完成后，室溫存放6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

注1：對(duì)于六孔板中一個(gè)孔的細(xì)胞，LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑的用量可以在2-6μl范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)(如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞毒性，可以把LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑的用量在2-4μl范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié))，siRNA用量可以在50-250pmol的范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。通常siRNA用量(pmol)和LipoRNAi™ (μl)的用量比例為25:1，如有必要可以在10:1-40:1的范圍內(nèi)優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果，上表推薦的比例為25:1，此時(shí)LipoRNAi™的用量相對(duì)較少，既經(jīng)濟(jì)又高效。最佳的轉(zhuǎn)染條件，不同的細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件有所不同，可以在上述推薦范圍內(nèi)自行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。
      注2：siRNA的推薦濃度為20µM，常用的濃度范圍為10-50µM。
      注3：對(duì)于多個(gè)孔轉(zhuǎn)染相同數(shù)量相同小RNA的情況可以把每個(gè)孔所需的LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑和siRNA按照相應(yīng)倍數(shù)加大用量，然后一起混合在同一個(gè)離心管內(nèi)，后續(xù)混勻后，可以按照推薦用量滴加到細(xì)胞培養(yǎng)器皿內(nèi)。
      注4：對(duì)于其它培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿，各種試劑的用量可以按照細(xì)胞培養(yǎng)器皿的培養(yǎng)面積按比例進(jìn)行換算。如果轉(zhuǎn)染寡核苷酸或RNA等可以參考轉(zhuǎn)染DNA的條件進(jìn)行。

      圖3. LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑與siRNA不同孵育時(shí)間對(duì)于靶基因下調(diào)效果的影響。LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑與STIM1-siRNA孵育圖中所示的時(shí)間后轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞通過(guò)Western blot檢測(cè)STIM1蛋白的下調(diào)效果。Western blot所使用的STIM1抗體(AF2614 Stromal interaction molecule 1 Rabbit Monoclonal Antibody)按照說(shuō)明書1:1000稀釋，二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L) (A0208) 1:1000稀釋。GAPDH為內(nèi)參。
d. 無(wú)論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，按照六孔板每孔125µl LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑-siRNA混合物的用量，均勻滴加到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕混勻。
e. 繼續(xù)培養(yǎng)約2天左右后，即可用適當(dāng)方式檢測(cè)siRNA對(duì)于靶基因的下調(diào)效果，例如qPCR、Western、ELISA、報(bào)告基因等。

常見(jiàn)問(wèn)題：
1. 轉(zhuǎn)染效率低：
a. 優(yōu)化小核酸與LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑比例，對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可適當(dāng)增加LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑的用量。
b. 應(yīng)使用高純度、無(wú)菌、無(wú)污染物的siRNA等小核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
c. 貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)狀態(tài)良好，細(xì)胞密度達(dá)70-80%時(shí)才可進(jìn)行轉(zhuǎn)染，過(guò)稀或過(guò)密都可能影響轉(zhuǎn)染效率，不同細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染密度需要自行摸索。懸浮細(xì)胞宜在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
d. 需使用無(wú)抗生素和無(wú)血清培養(yǎng)液配制LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑和siRNA等小RNA的混合物。
e. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間不足，而被誤以為轉(zhuǎn)染效率偏低。不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染后至顯著表達(dá)所需要培養(yǎng)的時(shí)間通常為約48小時(shí)。
f. 檢查細(xì)胞是否有支原體感染，支原體感染會(huì)影響細(xì)胞增殖，并很可能影響轉(zhuǎn)染效率。
g. 使用傳代次數(shù)相對(duì)較少的細(xì)胞，細(xì)胞傳代次數(shù)太多，對(duì)轉(zhuǎn)染效率會(huì)有一定的影響。
h. 如果沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)水平的變化，應(yīng)該仔細(xì)核對(duì)轉(zhuǎn)染用的小RNA等，確保測(cè)序結(jié)果和讀碼框完全正確。
i. 如果靶基因的敲減(knockdown)效果欠佳，應(yīng)該考慮嘗試設(shè)計(jì)不同的siRNA。

2. 出現(xiàn)一定程度的細(xì)胞毒性：
a. 轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞至少鋪板18-24小時(shí)。
b. 減少siRNA用量，按照比例減少LipoRNAi™轉(zhuǎn)染試劑。
c. 檢查是否轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度太低。
d. 檢查細(xì)胞是否有支原體等微生物污染。
e. 在細(xì)胞培養(yǎng)4-6小時(shí)之后進(jìn)行換液。

附錄：
常用多孔板和培養(yǎng)皿的尺寸、培養(yǎng)面積、細(xì)胞培養(yǎng)量和推薦的培養(yǎng)體積等相關(guān)數(shù)據(jù)表：

  *Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.
  **These wells or dishes are square.