Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡實驗步驟與常見問題分析

Annexin V/PI 雙染法流式檢測細胞凋亡是最常用的檢測細胞凋亡的方法之一。在細胞開始早期凋亡時， PS 會外翻到細胞表面，即細胞膜外側(cè)。用綠色熒光探針 YF488 標記的 Annexin V，可以結(jié)合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測細胞凋亡的重要特征。 碘化丙啶（ Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞的細胞核。 PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

因此將 YF 488-Annexin V 與 PI 匹配使用，就可區(qū)分活細胞、早晚期凋亡細胞和死細胞。

YF488 染料與傳統(tǒng) FITC 相比，熒光亮度更高，且不受環(huán)境中 pH 的影響，具有良好的光穩(wěn)定性。

 

一、操作步驟（貼壁細胞為例）

1.1 對照管的設(shè)置

（1）空白管：誘導(dǎo)凋亡的細胞不加染料，用來調(diào)節(jié)電壓；

（2）單染管：分別需要只加 PI 和熒光標記的 Annexin V 兩個單染管，用來調(diào)節(jié)補償；

（3）實驗管：誘導(dǎo)凋亡的細胞加本次實驗的所有熒光染料；

（4）陰性管：正常培養(yǎng)細胞加入染料，確認細胞正常狀態(tài)，排除假陽性

1.2 細胞處理及染色

（1）取對數(shù)生長期細胞接種于 6 孔板或 6cm 培養(yǎng)皿（用什么培養(yǎng)皿取決于所培養(yǎng)的細胞，保證最終收集的細胞數(shù)大于 5×105 個）；

（2）根據(jù)實驗需要處理細胞。收集細胞時將培養(yǎng)液吸至離心管內(nèi)，PBS 洗滌細胞一次，用不含 EDTA 的胰酶消化細胞，并收集于離心管中（懸浮細胞可直接離心收集）；

注：用胰蛋白酶消化然后使細胞在最佳細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 分鐘，然后再染色。 胰蛋白酶消化會暫時破壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽性染色。

（3）將收集的培養(yǎng)基和細胞混勻，4℃ 300g 離心 5min，棄上清。用預(yù)冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，每次 4℃ 300g 離心 5min；

（4）加入 1× Binding Buffer，將細胞調(diào)節(jié)成相同濃度（一般為 1×106/mL）；

（5）取 1-2×105 個細胞懸液于流式管中，加入適量標記了熒光染料的 Annexin V 和適量 PI，輕輕混勻；

（6）室溫避光孵育 15-20 min；

（7）加入 300 μl PBS 重懸細胞，盡快（1 小時內(nèi)）用流式細胞儀檢測。

PS：對照管設(shè)置尤其重要

 

二、實驗結(jié)果圖

2.1 YF488-Annexin V 熒光顯微鏡實驗效果

 

2.2 YF488 -Annexin V 流式實驗效果圖

 

YF 488-Annexin V 與 PI 雙染試劑盒能夠完美的區(qū)分活細胞，早期凋亡細胞及晚期凋亡細胞/壞死細胞。

 

三、常見問題

3.1 各象限代表的細胞狀態(tài)問題

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實驗結(jié)果越不可信，建議實驗中盡量控制這一象限細胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。

 

3.2 補償調(diào)節(jié)問題

（1）不同的染料組合，補償大小不同。

（2）電壓對補償?shù)挠绊懖恍�，電壓變補償變，所以我們要先調(diào)節(jié)FSC、SSC和熒光通道的電壓，電壓調(diào)好之后再調(diào)補償。

（3）細胞也是影響補償大小的一個因素，如淋巴細胞和腫瘤細胞之間、活細胞與固定后細胞之間，標記相同的熒光素偶聯(lián)抗體，使用相同的通道時，各通道之間的補償可能不同。所以當細胞理化性質(zhì)差異較大時，最好重新調(diào)節(jié)新的樣品細胞的補償，確保獲得準確的流式結(jié)果。

 

3.3 關(guān)于假陽性問題

（1）對貼壁細胞而言，消化是最關(guān)鍵的步驟，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因為 Annexin V 和 PS 的結(jié)合需要 Ca²⁺，而 EDTA 是 Ca²⁺ 螯合劑，使用含有 EDTA 的胰酶會造成假陰性。其次消化時間不宜過長，吹打細胞要輕柔，因為胰酶的過度消化和機械損傷都會引起細胞膜的損傷，造成假陽性。細胞消化下來后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育 30min，使細胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽性，或者將細胞報訊在含 2% BSA 的 PBS 中，防止進一步的損傷。

（2）神經(jīng)細胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測細胞凋亡不適用于神經(jīng)細胞。

 

3.4 關(guān)于熒光染料選擇的問題

（1） 對于熒光染料的選擇，建議如果流式細胞儀帶有 488 nm 和 633 nm 兩個或以上激光管，首先考慮用 APC 或 YF647 標記 Annexin V，因為它和 PI 通道幾乎不用考慮光重疊問題，可以減少調(diào)節(jié)補償?shù)臒�惱，如果只�?488 nm 激光管則可選擇YF488/FITC 標記的 Annexin V。

（2）再次需要考慮細胞是否自帶熒光，因為感染病毒或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞往往帶 GFP 熒光，GFP 與 YF488/FITC 通道重疊，不能選擇 YF488/FITC 標記的 Annexin V，此時如果只有 488 nm 一根激光管可以用 PE 標記 Annexin V，用 7-AAD 代替 PI，或者改用 YF647 Annexin V 代替 YF488。

（3）最后還要考慮處理因素是否帶有熒光，本實驗室就碰到過一個促凋亡藥物 Doxorubicin 本身發(fā)紅色熒光，對 PI 通道的檢測造成嚴重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時建議選用其他檢測方法。

 

3.5 設(shè)門問題

（1）要特別注意在FSC/SSC圈門時，所選細胞范圍會對結(jié)果造成較大影響，所以在分析數(shù)據(jù)時，要把所有細胞都圈進FSC/SSC的門內(nèi)，這樣實驗結(jié)果才會更可信。如圖，使細胞群大概位于對角線上，并且細胞群較集中，群內(nèi)細胞比例要在80%以上，如果細胞全部圈入，細胞比例才50%或者更低，說明細胞被壓在了坐標軸上，這時要重新調(diào)節(jié)FSC和SSC。

 

（2）貼壁細胞做Annexin V凋亡檢測，通常分群不太規(guī)則，這時我們可以根據(jù)不加藥細胞來畫不規(guī)則的十字門。如下面圖形的設(shè)門方式。

 

3.6 免疫染色與凋亡染色順序問題

Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對細胞進行染色嗎？

可以，但建議Annexin V和其它抗體分開染色。 例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時標記淋巴細胞，可以先在PBS中標記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標記Annexin V。

 

3.7 其他問題

（1）液氮保存的組織塊，不建議再做流式細胞分析。因為流式細胞分析要求細胞分散、單個，活性好，組織在凍存、復(fù)溫的過程中會有大量的細胞死亡，同時經(jīng)過這一過程的組織在分離成單個細胞的時候會形成許多細胞碎片，不宜上流式檢測，所以用于流式檢測的標本最好是新鮮標本，即取材后立即檢測，效果最好。 液氮保存的組織塊，可以將組織標本進行切片，然后做原位染色，觀察組織細胞的凋亡。

（2） Annexin V也可以用在植物和細菌中檢測凋亡，具體實驗步驟可參考相關(guān)文獻。

（3） 如果樣品來源于血液，必須去除血液中的血小板，因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，干擾實驗結(jié)果。

（4）操作中務(wù)必動作輕柔，離心后確認管底是否有細胞，經(jīng)常有人液體一甩，細胞也給甩走了。操作中還要注意避光。