D-螢光素在生物發(fā)光檢測(cè)中的應(yīng)用
■ Q: D-螢光素的作用原理
D-螢光素 (D-Luciferin) 是螢火蟲(chóng)螢光素酶 (Firefly Luciferase) 的化學(xué)發(fā)光底物。在ATP 和螢光素酶存在下，螢光素能夠被氧化發(fā)光 (圖 1)。當(dāng)螢光素過(guò)量時(shí)，發(fā)光亮度與螢光素酶濃度呈正相關(guān)。通過(guò)螢光素/螢光素酶生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測(cè)基因表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)、藥物反應(yīng)等。
■ Q: 游離態(tài)和鹽形式的 D-螢光素，怎么選？
目前市面上主要有 3 種 D-螢光素，D-螢光素游離酸 (HY-12591A)、鈉鹽 (HY-12591) 和鉀鹽 (HY-12591B)。D-螢光素鈉鹽、鉀鹽易溶于水，而游離酸形式難溶于水，需要適當(dāng)?shù)膲A中和才能溶于水。配成溶液后，這 3 種形式的 D-螢光素生物活性相當(dāng)。
■ Q: 外生物發(fā)光、體內(nèi)活體成像的檢測(cè)怎么操作？
以 D-螢光素鉀鹽為例：
1、體外生物發(fā)光檢測(cè) (In vitro bioluminescent assays)
1) 將細(xì)胞鋪在 24 孔黑孔板上，鋪板密度為 0.5-2.0×105 個(gè)細(xì)胞/孔，37℃，培養(yǎng)過(guò)夜。
2) 用超純水配制 15 mg/mL 的 D-螢光素儲(chǔ)存液 (100×)。
注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后-20℃ 避光凍存，有效期 1 個(gè)月。
3) 用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基 1: 100 稀釋儲(chǔ)存液，配制終濃度 150 μg/mL 的 D-螢光素工作液 (1×)。
4) 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無(wú)殘留。
5) 向細(xì)胞內(nèi)添加 1×D-螢光素工作液后，立即進(jìn)行圖像分析。
圖 2. MDA-MB-231-Luc2 細(xì)胞生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果[1](客戶驗(yàn)證)
2、小鼠活體成像分析 (In vivo analysis in mice)
1) 用無(wú)菌的 DPBS (no Mg2+、Ca2+) 配制 15 mg/mL 的 D-螢光素溶液，0.2 μm 濾膜過(guò)濾除菌。
注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后 -20℃ 避光凍存，有效期 1 個(gè)月。
2) 按 150 mg/kg 劑量和 10 μL/g 注射體積向每支小鼠注射相應(yīng)量的 15 mg/mL D-螢光素溶液。
3) 腹腔或靜脈注射 5-15 min 后進(jìn)行活體成像分析。
圖 3. 小鼠活體成像結(jié)果[2](客戶驗(yàn)證)
D-螢光素 (D-Luciferin) 是螢火蟲(chóng)螢光素酶 (Firefly Luciferase) 的化學(xué)發(fā)光底物。在ATP 和螢光素酶存在下，螢光素能夠被氧化發(fā)光 (圖 1)。當(dāng)螢光素過(guò)量時(shí)，發(fā)光亮度與螢光素酶濃度呈正相關(guān)。通過(guò)螢光素/螢光素酶生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測(cè)基因表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)、藥物反應(yīng)等。
圖 1. D-螢光素發(fā)光原理
■ Q: 游離態(tài)和鹽形式的 D-螢光素，怎么選？
目前市面上主要有 3 種 D-螢光素，D-螢光素游離酸 (HY-12591A)、鈉鹽 (HY-12591) 和鉀鹽 (HY-12591B)。D-螢光素鈉鹽、鉀鹽易溶于水，而游離酸形式難溶于水，需要適當(dāng)?shù)膲A中和才能溶于水。配成溶液后，這 3 種形式的 D-螢光素生物活性相當(dāng)。
■ Q: 外生物發(fā)光、體內(nèi)活體成像的檢測(cè)怎么操作？
以 D-螢光素鉀鹽為例：
1、體外生物發(fā)光檢測(cè) (In vitro bioluminescent assays)
1) 將細(xì)胞鋪在 24 孔黑孔板上，鋪板密度為 0.5-2.0×105 個(gè)細(xì)胞/孔，37℃，培養(yǎng)過(guò)夜。
2) 用超純水配制 15 mg/mL 的 D-螢光素儲(chǔ)存液 (100×)。
注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后-20℃ 避光凍存，有效期 1 個(gè)月。
3) 用預(yù)熱好的細(xì)胞培養(yǎng)基 1: 100 稀釋儲(chǔ)存液，配制終濃度 150 μg/mL 的 D-螢光素工作液 (1×)。
4) 去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無(wú)殘留。
5) 向細(xì)胞內(nèi)添加 1×D-螢光素工作液后，立即進(jìn)行圖像分析。
圖 2. MDA-MB-231-Luc2 細(xì)胞生物發(fā)光檢測(cè)結(jié)果[1](客戶驗(yàn)證)
2、小鼠活體成像分析 (In vivo analysis in mice)
1) 用無(wú)菌的 DPBS (no Mg2+、Ca2+) 配制 15 mg/mL 的 D-螢光素溶液，0.2 μm 濾膜過(guò)濾除菌。
注：D-螢光素溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，也可分裝后 -20℃ 避光凍存，有效期 1 個(gè)月。
2) 按 150 mg/kg 劑量和 10 μL/g 注射體積向每支小鼠注射相應(yīng)量的 15 mg/mL D-螢光素溶液。
3) 腹腔或靜脈注射 5-15 min 后進(jìn)行活體成像分析。
圖 3. 小鼠活體成像結(jié)果[2](客戶驗(yàn)證)
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